1、1分子生物学实验姓名：专业：学号：2目 录实验一 细菌培养实验二 质粒 DNA 提取实验三 琼脂糖凝胶电泳实验四 质粒 DNA 酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验五 聚合酶链 式反应（PCR）技术体外扩增 DNA实验六 地高辛标记的 Southern 杂交3实验一 细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。大肠杆菌是含有长约 3000kb 的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养
2、基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以 2030min 复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 11092109/mL。培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是 LB 培养基。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1. 胰蛋白胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养皿2. 带帽试管3.
3、涂布器4. 灭菌锅5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（一）LB 培养基的配制配制每升培养基，应在 950m1 去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用 1mol/L NaOH 调节 pH 位至 7.0。加入去离子水至总体积为 lL，在 15 lbfin 2 (1.034105Pa)高压下蒸气灭菌 20 分钟。这样得到是 LB 液体培养基。LB 固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉 15g/L。（二）细菌的培养（）在液体培养基中培养41.过夜培养（1）先在 LA 液体培养基中加
4、入氨苄青霉素，50l/50ml。（2）取 34ml 液体培养基加入一只无菌的试管中。（3）用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。（4）盖好试管，在摇床上以 60r/min 速度，于 37过夜培养。.大体积培养（1）按 1100（V/V）的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的 5 倍以上。（2）于 37，约 200r/min 剧烈摇动培养。（）在固体培养基中培养 细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。平板划线法分离单菌落（1）采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。（2）重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复
5、划线直至覆盖整个平板。 （见下图）（3）于 37培养直至长出单菌落。五、实验结果与讨论LB 液体培养基是淡黄色清液，接种大肠杆菌过夜培养后，若有细菌生长，则培养基变浑浊（说明菌体复苏生长） 。本次实验成功得到大肠杆菌培养液。5实验二 质粒 DNA 的提取一、目的学习碱裂解法提取质粒的原理二、原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的 DNA 分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具载体。质粒 DNA 的提取是依据质粒 DNA 分子较染色体 DNA 分子小，且具有超螺旋共价闭合环
6、状的特点，从而将质粒 DNA 与大肠杆菌染色体 DNA 分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒 DNA 氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当 pH=4.8 的乙酸钠将其 pH 调到中性时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体 DNA 不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体 DNA
7、 与大分子 RNA、蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料含质粒的大肠杆菌 DH5（二）试剂1. LB 液体培养基：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，溶解于 1000mL 蒸馏水中，用 NaOH 调 pH 至 7.0。高压灭菌 20 分钟。2. LB 平板培养基：在每 1000mL LB 液体培养基中中加入 15g 琼脂，高压灭菌 20分钟。（三）仪器1. Eppendorf 管、离心管架2. 10，100，1000 l 微量加样器3. 台式高速离心机4. 摇床、高压灭菌锅四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种
8、于 LB 平板培养基上， 37培养 24 小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于 5ml 液体培养基中，37培养 12 小时。（二）提取步骤1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入 500L 的平衡液BL，12,000rpm（13,400g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 （请使用当天处理过的柱子）2、取1-5 mL 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，10000rpm（13,400 g）离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中） 。3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250L 溶液P1（请先
9、检查是否已加入RNaseA） ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。6【现象：均匀振荡，直至看不见菌块，菌液变为乳白色。注意：如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低】4、向离心管中加入250L 溶液P2，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。【现象：此时菌体裂解，菌液变得清亮粘稠。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA 断裂片段。该步骤操作应快，所用时间不超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 】5、向离心管中加入350L 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8 次，充分混
10、匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm（13,400g）离心 10min，此时在离心管底部形成沉淀。【现象：产生白色絮状物。注意：P3加入后应立刻混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 】6、将上一步收集的上清液（只转移800L上清液）用移液器转移到吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中） ，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm （13,400g）离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。7、向吸附柱CP3 中加入 600L 漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇） ，12,000rpm（13,400 g）离心 30
11、-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。8、重复操作步骤7。9、将吸附柱CP3 放入收集管中， 12,000rpm（13,400g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。【漂洗液中的乙醇残余会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱CP3开盖，置于超净工作台上风干五分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 】10、将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100L 洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm（13,400g）离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。(三) 琼脂糖凝胶
12、电泳法检测提取的质粒 DNA7五、实验结果与分析注：泳道 5 为 Ladder，最上方条带为 2kb分析：由结果与 Ladder 比对可知，成功提取出 3.5kb 的质粒。六、讨论（一）P1，P2，P3 的成分P1：葡萄糖（提供渗透压，避免细胞破裂） ，RNA 酶，盐酸，EDTA（螯合出核酸酶的金属离子，避免 DNA 被降解）P2：SDS（一种去污剂，易起泡，溶解细胞膜） ，NaOH（碱性物质，促进肽聚糖水解，帮助裂解细胞膜）P3：醋酸和醋酸钾， PH4.85.2（二）P1，P2，P3 的作用P1：起着悬浮细菌的作用,PH 值为中性。P2：起着裂解细菌的作用,为碱性,这一步又称为碱裂解。P3
13、为酸性,中合 P3.P2 加了一倍,P3 也加一倍,同样起到中和的作用 .当然,如果你用试剂盒提,最后离心上柱的液体量会多一些,一次加不完可两次加入.电泳时在样品中加入溴酚蓝的目的，以及在溴酚蓝中加入甘油和蔗糖的原因1、加入溴酚蓝的目的:（1） 溴酚蓝呈蓝色，而蛋白质是白色，在凝胶中不明显。（2）溴酚蓝的相对分子量比蛋白质(绝大部分)小，电泳时速度比蛋白质稍快，因此可用作指示。（3）可以根据溴酚蓝电泳产生的蓝色条带位置判断电泳结束时间（一般当溴酚蓝跑到末端时停止电泳） 。若无溴酚蓝，不好把握蛋白质电泳到槽底的时间。如果所有的蛋白质都电泳到了底部，就不能区别出其移动速度对应于相对分子质量的关系。
14、2、加入蔗糖和甘油的目的: 跑胶前都会在 Buffer(缓冲器)里的，并要和样品充分混合，只是因为蔗糖和甘油比重大，可以使样品沉到点样孔中，在点样孔底部铺成一线，避免样品漂逸，从而可以最大限度地跑到胶里去，得到更好的实验结果。8实验三 琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA一.目的学习琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA 的纯度，DNA 的构型，含量以及分子量的大小。二.原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA 就能检测。其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当 DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的 EB 就插入 DNA 分子中形成荧光络合物；使得DNA
15、发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于 DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需 510ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到 0.010.1ng 的 DNA。在凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测 DNA 分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以
16、在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。当然也可以用同样的方法检测 RNA。三、试剂与主要仪器（一）试剂1. DNA 样品2. TBE 缓冲液（5）：用时需稀释 10 倍（配制见附录）3. 点样缓冲液 Loading buffer（10）：0.25% 溴酚蓝，40%甘油4. 溴乙啶(EB) ：10mg/ml 溴乙啶 （注意：该试剂具致癌作用，用时要小心）5. 琼脂糖（二）仪器1. 电泳仪系统2. 紫外灯3. 恒温水浴箱四、操作步骤1.选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平
17、，检测稳压电源与正负极的线路。2.选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为 0.51.0mm。3.制备琼脂糖凝胶：按照被分离的 DAN 分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：9琼脂糖的含量（%）分离线装 DNA 分子的有限范围(kb)0.3 6050.6 2010.7 100.80.9 70.51.2 60.41.5 40.22.0 30.1称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约 40ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加热，至琼脂糖融化均匀。 【本次大实验琼脂糖含量主要为 0.70.9%。 】4.将凝胶槽洗净擦干，两端用胶
18、布封好，并在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60左右时，在凝胶溶液中加 EB（EB 最终浓度为 0.5 微克/毫升） ，摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入 TBE 缓冲液） ，然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。注意：缓冲液要高出凝胶面 2。5.待测的 DNA 样品中，加入 1/5 体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样品点样顺序和点样量。6.开启电源开关，最高电压不超过 5V/cm。7.泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA 各条区带分开后电泳结束。一般 20 分钟至 3 小时，取出电泳凝胶块直
19、接检测拍照。【注意事项：制胶过程中如果出现气泡，应及时挑破，以免影响后续的跑胶过程】10实验四 质粒 DNA 酶切及琼脂糖电泳分析鉴定一、目的学习质粒的酶切及电泳分析。二、原理限制性内切酶可以识别双链 DNA 特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于 DNA 片段再连接。限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量 DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知 DNA 的相对分子质量。质粒 DNA
20、在细胞内有三种构象：共价闭环 DNA，常以超螺旋形式存在； 如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA； 线状 DNA，双链 DNA 断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环 DNA迁移率最大，其次是线状 DNA 和开环 DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现23 条区带。三、试剂与主要仪器（一）试剂1.EcoR酶2.DNA3.TBE 缓冲液（5）：用时需稀释 10 倍4.点样缓冲液 Loading buffer（10）：0.25% 溴酚蓝，40%甘油5.溴乙啶(EB) ：10mg/ml 溴乙啶 （注意：该试剂具致癌作用，用时要小心）6.琼脂糖（二）仪
21、器1.电泳仪系统2.紫外灯3.恒温水浴箱四、操作步骤（一）质粒 DNA 酶切1. 按下表将各种试剂分别加入每个 Eppendorf 管中:2. 加样后混匀， 置于 37水浴中，保温 2 小时。然后每个管中加入 2l Loading buffer。（二）琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖凝胶的制备称取 0.4g 琼脂糖加入 40ml 0.5TBE 缓冲液中，加热熔解。冷却至 65时加入 2l EB，混匀。2.胶板制备质粒 DNA 15EcoR/l 3酶切 Buffer（10）/l 2ddH2O/l 1011将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端
22、封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入 0.5 TBE缓冲液） ，拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面 2 毫米。3. 加样每个样品中加入 1/10 体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。4. 电泳观察接通电源，电压为 80V，电泳 1 小时左右，当溴酚蓝到达下沿 1-2处时，停止电泳。5. 观察及照相将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。五、实验结果与讨论分析注：泳道 2 为 Marker，其余泳道为小组成员样品，泳道 6 为我加的样品。分析：由电泳结果 Ladder 比较可知，500bp 处有一条较浅的条带，含量十分少，是酶
23、切得到的片段。上方较亮的的条带是 3kb，这是酶切后剩余的质粒。由于酶切后产生的相同粘性末端，因此也可以发生互补连接，形成环状。 电泳结果说明成功得到酶切片段。12实验五 聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增 DNA一、目的1.学习 PCR 反应的基本原理和实验技术。2.了解引物设计的一般要求。二、原理聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR ）是体外酶促合成 DNA 片段的一种技术。利用 PCR 技术可在数小时之内大量扩增目的基因或 DNA 片段，以用于基因工程操作。PCR 进行的基本条件：DNA 模板（在 RT-PCR 中模板是 RNA）引物dNTP（dATP
24、、dTTP 、 dGTP、dCTP ）Taq DNA 聚合酶反应缓冲体系PCR 循环由三个步骤组成：变性 使模板 DNA 解离成单链；退火 使引物与模板 DNA 所需扩增序列结合；延伸 DNA 聚合酶利用 dNTP 合成与模板碱基序列互补的 DNA 链。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过 30 个左右循环后，目的片段的扩增可达 106 倍。引物设计：要保证 PCR 反应能准确，特异，有效的对引物 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：引物长度：1525 个核苷酸； GC 含量为 40%60%；Tm 值为 55（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算；引物与非特异配对位点的配对率
25、小于 70%；引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于 3，两条引物间配对碱基数小于 5 个。由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。本实验以实验二中提取的质粒 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，大量得到目的 DNA片段。三、试剂与仪器（一）试剂1. Taq DNA 聚合酶2.10反应缓冲液（含 25mmol MgCl2）3.dNTP134.引物（P1、 P2）5.溴乙啶 (EB)： 10mg/ml 溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6.点样缓冲液 Loading buffer（10）：0.25% 溴酚蓝，40%甘油。（二）仪器1. PCR 扩增仪2.电泳
26、仪3.台式离心机4.紫外分析仪5.恒温水浴6.凝胶成像系统四、操作步骤（一）PCR 扩增1.按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒 DNA。试剂 体积（ 30l）ddH2O 9.5lPrimer M13F（10M） 1lPrimer M13R（10 M） 1l模板 1l2 x Taq Mix 12.5l【2 x Taq Mix ：Taq，Tris Kel，dNTP（浓度为 2.5mmol） ，Mg+/Mn+】【Mg+浓度上升，扩增增多但易出杂带；浓度低扩增慢但特异性高】2.设置 PCR 程序：94 180s 94 45s33 cycles: 55 45s72 45s 72 600
27、s3.运行 PCR 程序（二）PCR 产物鉴定反应结束后，取 20l PCR 产物进行 1.2% 琼脂糖电泳分析。14五、实验结果分析：与 Ladder 比较可知，主条带位于 500bp 与 750bp 之间，大约为 600bp，这是由于目标DNA 为 500bp，扩增后的产物为目标 DNA500bp 和其两端的引物片段长度，因此大于目标 DNA 的长度。由实验结果可知，通过 PCR 扩增成功得到了目标 DNA 片段。15实验六 地高辛标记的 Southern 杂交一、目的学习 Southern 杂交的原理及操作方法。二、原理1975 年 Southern 发明了 Southern blot
28、分子杂交方法。这项技术包括在琼脂糖凝胶上按片段大小电泳分离待检的 DNA；用 NaOH 对凝胶中的 DNA 进行变性处理；通过毛细管作用将单链 DNA 吸附到硝酸纤维素膜上；然后用标记好的探针进行杂交，洗掉没有杂交的游离探针；经放射性自显影（放射性标记探针）或生化检测（非放射性标记）就可以证明基因片段与已知探针是否具有同源性，达到检测样品基因的目的。因此，Southern 印迹杂交包括两个步骤把电泳分级的 DNA 转移到固定支持膜上。与标记的 DNA 探针杂交。地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP 、dTTP 和
29、D1G-11-dUTP 作为合成底物，以单链 DNA 作为模板，在 Klenow 酶的作用下，合成插入地高辛的 DNA 链。以地高辛标记的探针与靶基因 DNA 链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT 显色，敏感性很高。所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1SSC,0.1%SD
30、S）煮沸 5-10 分钟后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。三、试剂与器材（一）试剂1. DIG Random Labeling Mix（高效）2. Anti-DIG-AP Conjugate3. BCIP/NBT Stock Solution 4. Blocking Reagent5. 20SSC：0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl6. 2SSC：0.03M 柠檬酸钠，0.3M NaCl7. 0.2M EDTA8. 变性液：0.5N NaOH， 1.5M NaCl9. 中和度：0.5M Tris-HCl，pH7.4，3M NaC
31、l10. Standard buffer：5SSC，0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 0.02% (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent。11. Standard buffer+50% formamide12. Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体13. BCIP/NBT 储备液：14. 冲洗液：0. 1M Tris-HCl，0.15 M NaCl. pH=7.5.15. 封闭液：1%Blocking Reagent/ 0.1M Tris-HCl， 0.15M NaCl.16. 显色缓冲液：0.1mM Tris-HCl，0.1M
32、NaCl，pH=9.5【碱性磷酸酶要在碱性条件下反应】.1617. TE 缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.018 . Wash Solution I :2x SSC, 0.1%SDS19. Wash Solution II: 0.5x SSC , 0.1%SDS（二）仪器1. 台式离心机2. 恒温水浴3. 白磁盘4. 杂交炉5. 电泳系统6. 硝酸纤维素膜或尼龙膜7. 封口机四、操作步骤（一）探针的标记1.用灭菌去离子蒸馏水稀释 1g DNA 至总体积 16l。2. DNA 热变性：把 DNA 置于沸水中，水浴 10 分钟。然后，迅速地插入碎冰中 3分钟以上。3
33、. 加 4l DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再 2000RPM 离心 5 分钟。4. 置于 37反应至少 120 分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至 20 小时可明显增加地高辛标记 DNA 的产量。应根据需要控制反应时间。5. 加入 2l EDTA 以终止反应，对于原位杂交和膜反应杂交来说，标记反应可告结束，上述反应液置于-20 保存至少一年以上。且可反复使用。可根据下表估计标记产量：单位（ng）DNA 模板量 标记一小时标记二十小时10 45 60030 130 1050100 270 1500300 450 20001000 850 23003000
34、1350 2650（二）Southern 转移1. 将目的基因经琼脂糖凝胶电泳的胶板从电泳槽中取出，凝胶浸入 0.25M HCl 中 10 分钟。HCl 处理的作用主要是通过嘌呤使 DNA 分子断裂，因而有利于高分子量DNA 的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于 10kb 的 DNA 片段时可省略此步骤。2. 进入变性液之前，用蒸馏水漂洗 20-30 分钟。3. 把凝胶浸入变性液中，室温浸泡 15 分钟2 次。4. 蒸馏水漂洗凝胶 2 次。5. 把凝胶浸入中和液中，室温浸泡 15 分钟2 次。6. 处理凝胶的同时，切一张同样大小的尼龙膜或者硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜用 2SSC 浸泡。剪
35、两张 Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸。 （注意不要用手直接触及17膜面）7. 准备转移用平器和支架，平器中放 20SSC。支架上搭滤纸桥使得溶液能够虹吸上来。8. 依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水纸，玻璃板，适量重物（500-1000g） 。注意：检查 pH 值，用硝酸膜时 pH线状超螺旋闭合环状。条带也可能有中间复合体状态显色说明实验成功六、讨论（一）探针需要有两个特性：1、同源性 2、示踪性（二）Standard buffer 中的 1% Blocking Reagent：来自鲑鱼精子的 DNA，其特异性特别强，所以先让膜吸附 Blocking Reagent，然后再加入探针时不会与其配对，其作用是作为封堵试剂防止其他地方吸收探针。（三）封闭液：针对 Western 杂交的试剂，用蛋白封闭其余地方（四）Wash Solution 中 SSC 作用：是一种钠盐，可以洗掉非特异性的 ssDNA 探针，却洗不掉特异性探针。盐离子浓度越低，洗膜越好，浓度越高，洗膜越差，因此，Wash Solution II 更为重要。19
