1、高效液相色谱法测定酒豨莶草中奇壬醇的含量 (刘赞 1，侴桂新 2*，王峥涛 1, 2（1. 中国药科大学，江苏 南京 210038；2. 上海中药标准化研究中心，上海 201203；）摘要 目的 ：建立测定酒豨莶草中奇壬醇含量的高效液相色谱方法。 方法：Boston Crest ODS 色谱柱（4.6 mm250 mm，5 m） ；以乙腈为流动相 A，以水为流动相 B，进行梯度洗脱；检测波长 215 nm，流速 1.0 mLmin-1。 结果：奇壬醇在 0.020 220.02 g 呈良好的线性关系（r=0.999 75） ，该方法平均回收率为 99.62%，RSD 2.0%。 结论：该方法简
2、便易行、准确、重现性好，可用于酒豨莶草中奇壬醇的含量测定。关键词 酒豨莶草；奇壬醇；高效液相色谱法；含量测定酒豨莶草为中药豨莶草的炮制加工品，生豨莶草和酒豨莶草均为临床常用药。传统认为生豨莶草以清肝热、解毒邪为主，用于痈肿疔疮、风疹、湿疹、风湿热痹、湿热黄疸等症；酒蒸后祛风湿、强筋骨力强，并具有补肝肾的作用，用于中风偏瘫、风湿痹痛、腰膝酸软、无力等症 1, 2。2005 年版 中国药典收载酒豨莶草于豨莶草的炮制项下，炮制方法照酒蒸法（2005 年版中国药典二部附录 D） ，每 100 kg 净豨莶草段，用黄酒 20 kg 蒸透，晾干，即得。由于该标准尚无质量控制方法，为有效控制本品质量，本研究
3、旨在建立以奇壬醇为指标成分的含量测定方法。1 仪器与试药高效液相色谱仪（Waters e2695 alliance Separation Module, Waters 2998 Photodiode Arrary Detector, Empower 2 工作站，美国 Waters 公司） ；电热恒温水浴锅（DK-S24 型，上海精宏实验设备有限公司） ；电子天平（Sartorius BT 124 S ，北京赛多利斯仪器系统有限公司） 。奇壬醇对照品（上海中药标准化研究中心提供，纯度98%） ；甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯，水为哇哈哈纯净水。购买不同产地的酒豨莶草及净豨莶草段，经上海中药标准化研究
4、中心吴立宏博士鉴定，照药典方法自制得酒豨莶草。2 方法收稿日期 基金项目 中国药典2010 版一部标准研究课题任务书（YS-178） ；上海市科学技术委员会中药现代化专项课题（08DZ1970103）通信作者 *侴桂新，研究员，中药学。Tel: (021) 51322507, 作者简介 刘赞，硕士生，生药学。Tel: 13764235239, 2.1 色谱条件 Boston Crest ODS 色谱柱（4.6 mm250 mm，5 m） ；以乙腈为流动相 A，以水为流动相 B，梯度洗脱 05 min（5%24% A） ，540 min（24% A） ；检测波长 215 nm，流速 1.0 mL
5、min-1，柱温 35 。理论板数按奇壬醇峰计算不低于 5 000。2.2 对照品溶液的制备 取奇壬醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL 含 20 g 的溶液，即得。2.3 供试品溶液的制备 程志红等 3采用石油醚索氏提取脱脂后，再用甲醇加热回流的方法制备供试品。作者对比了经石油醚脱脂与不脱脂制备的供试品的 HPLC 图，在指标成分奇壬醇峰附近均无影响其分离的干扰成分。因此，本实验采用直接甲醇回流的方法进行供试品的制备。确定提取溶剂为甲醇，提取方法为水浴加热回流，用 L9（3 3）正交试验表安排试验，因素水平、正交试验结果及方差分析分别见表 1，表 2，表 3。表 1 正交试验因素水
6、平因素水平 A提取次数/次B溶剂倍量/倍C提取时间/h1 1 25 12 2 50 23 3 100 3表 2 正交试验方案与结果正交实验 提取次数/次 溶剂倍量/倍 提取时间/h 平均单位峰面积1 1 25 1 532 979.782 1 50 2 558 312.583 1 100 3 570 803.074 2 25 2 553 414.305 2 50 3 597 936.156 2 100 1 556 489.657 3 25 3 610 219.598 3 50 1 576 822.419 3 100 2 593 494.37K1 1 662 095.44 1 696 613.67
7、 1 666 291.84K2 1 707 840.10 1 733 071.14 1 705 221.25K3 1 780 536.37 1 720 787.09 1 778 958.82R 118 440.93 36 457.47 112 666.98表 3 方差分析结果方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 值 显著性A 2.38109 2 1.19109 19.04 *B 2.29108 2 1.15108 1.83C 2.18109 2 1.09109 17.44误差 1.25108 2 6.23107“*”为有显著性差异。正交试验结果表明，最佳提取方案为 50 倍量溶剂提取 3 次
8、、每次提取 3 h。在 95%的置信限上，提取次数对试验结果有显著影响，其次为提取时间，但二者的影响相差不大。考虑到操作的简便性，确定提取溶剂倍量为 50 倍、提取次数为 1 次，继续考察提取时间。分别对回流提取 3, 4, 5, 6 h 进行了考察。根据考察结果，综合考虑提取效果和提取效率，选定提取时间为 5 h。提取时间 5 h、提取次数 3 次，合并每次滤液并浓缩至单次提取的溶剂倍量，以此结果作为完全提取的考察依据。计算得单次提取占完全提取的 94.89 %，认为该方案可行。故最终的供试品制备方法确定为：取本品粉末（过三号筛）约 1 g，精密称定，精密加入甲醇 50 mL，称重，80 水
9、浴加热，回流 5 h，放冷，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.4 检测限与定量限 按信噪比（S/N）为 3 时计算，奇壬醇的检测限为 2.012 ng；按信噪比（S/N）为 10 时计算，通过重复测定 5 次求得平均值（RSD 1.67%)，奇壬醇的定量限为10.06 ng。2.5 线性关系考察 取奇壬醇对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成含奇壬醇 1.001 mgmL-1 和 0.050 3 mgmL-1 对照品贮备溶液。将上述两份对照品贮备液分别稀释，得到1.01，5.03，25.15，50.30，100.10，200.20，400.40，60
10、0.60，800.80，1 001.00 mgL-1，共10 个浓度对照品溶液。分别精密吸取 20 L 注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。以对照品溶液浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得回归方程 Y =15 504 X +13 187，r =0.999 75。结果表明奇壬醇在 0.020 220.02 g 呈良好的线性关系。2.6 精密度试验 取奇壬醇对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含奇壬醇 0.050 3 gL-1 对照品溶液，连续进样 5 次，每次进样 20 L，奇壬醇平均峰面积的 RSD 0.05%。2.7 稳定性试验 取酒豨莶草（源和堂）供试品溶液
11、，分别于0，1，2，4，8，12，24，36，48，72 h 测定，奇壬醇平均峰面积的 RSD 1.9 %，表明供试品溶液 72 h 内稳定。2.8 重复性试验 取酒豨莶草样品（源和堂）按 3 项下方法平行制备 6 份供试品溶液，测定奇壬醇峰面积，其平均单位峰面积的 RSD 1.8%。2.9 回收率试验 取已知奇壬醇含量的酒豨莶草（源和堂）粉末 9 份，约 0.5 g，精密称定，分别按已知含量的 50，100，150% 3 个水平加入奇壬醇对照品，按 2.3 项下方法制备供试品溶液，测定奇壬醇的峰面积，计算回收率。结果见表 4。表 4 奇壬醇加样回收率试验结果称样量/g样品含有量/mg加入量/
12、mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.502 1 1.455 6 0.701 6 2.145 0 98.260.502 7 1.457 3 0.701 6 2.176 5 102.50.502 3 1.456 2 0.701 6 2.169 8 101.70.502 1 1.455 6 1.403 2 2.807 4 96.340.502 3 1.456 2 1.403 2 2.824 2 97.490.502 0 1.455 3 1.403 2 2.846 0 99.110.502 1 1.455 6 2.104 8 3.553 8 99.690.502 5 1.456 7
13、2.104 8 3.582 3 101.00.502 2 1.455 9 2.104 8 3.571 1 100.599.62 2.02.10 样品测定 取所收集并自制的 10 批酒豨莶草，打粉，过 50 目筛，每批样品平行制备两份供试品溶液，按上述建立的含量测定方法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 L，注入液相色谱仪进行测定，采用外标一点法计算奇壬醇的含量。结果见 5，HPLC 图见图 1。表 5 酒豨莶草中奇壬醇的百分含量（ n=2）样品来源 鉴定结果 平均百分含量 /%浙江临安（产地） 毛梗豨莶 0.048 5江苏（产地） 豨莶 0.082 8市售样品浙江（产地） 腺梗豨莶 0
14、.220 4安徽涡阳县源和堂 腺梗豨莶 0.310 7浙江建德怡生堂 腺梗豨莶 0.693 4合肥和义堂 腺梗豨莶 0.714 0北京同仁堂 腺梗豨莶 0.068 3自制样品上海雷允上 豨莶 0.076 0德国 叶（产地） 腺梗豨莶 1.780 4天津（收购地） 腺梗豨莶 0.176 3AU0.0.50.10.15AU0.0.50.10.15 分. 5.010. 15.020. 25.030. 35.040.图 1 奇壬醇对照品与供试品 HPLC 图A. 奇壬醇对照品；B. 酒豨莶草供试品；1. 奇壬醇峰原图见 附件3 讨论3.1 指标成分的确定 2005 年版中国药典收载豨莶草的质量控制指标
15、成分为奇壬醇，因为奇壬醇为三种药用豨莶草原植物的共有成分 4-6，专属性强且为主要的活性成分 7。本研究发现，炮制过程并不影响奇壬醇在酒豨莶草中的存在，所以酒豨莶草同样也选择奇壬醇作为质量控制指标。3.2 色谱条件的确定 2005 年版中国药典收载豨莶草含量测定的色谱条件，流动相为乙腈-水（ 2575）等度洗脱。本实验经过选用不同的色谱柱对比发现，等度洗脱的条件对于色谱柱的耐用性较差，不同的色谱柱对色谱图有很大影响；奇壬醇峰的背景干扰亦较大，难以达到基线分离；奇壬醇峰的峰形普遍较差，对称性不好。经过摸索，本实验建立的色谱条件能够很好克服上述不足，更为优化。参考文献1 胡慧华 . 豨莶丸的配方优
16、化及治疗实验性膝骨性关节炎的药效、机理探讨D. 北京：北京中医药大学11AB2 胡慧华, 汤鲁霞, 李小猛. 豨莶草生品和炮制品抗炎、抗风湿作用的实验研究J. 中国中药杂志, 2004, 29 (06) : 542.3 程志红, 侴桂新, 王峥涛. 豨莶草的质量标准研究J. 中国中药杂志, 2005, 30 (04) : 257.4 果德安, 张正高, 叶国庆, 等. 豨莶脂溶性成分的研究J. 药学学报, 1997, 32 (4) : 282.5 傅宏征, 楼之岑, 杨秀伟, 等. 腺梗豨莶的化学成分研究 1 J. 中草药, 1997, 28 (05) : 259.6 许云龙, 熊江, 金歧端
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