1、响应面分析法在高效脱硫菌性能研究中的应用 (张秀霞 孔甜甜 陈水泉 王志伟 邵珺 刘欣梅（中国石油大学 环境与安全工程系，山东 青岛 266580）摘要 从高硫污染的活性污泥中富集培养，分离纯化得到一株可以降解噻吩的菌株 S-4，并对该菌株的形态特征进行观察。应用 Design-Expert8.0.5b 软件进行响应面优化实验，研究了反应时间、噻吩浓度、微生物浓度 3 个因素的组合对菌株 S-4 脱硫效果的影响，并拟合得到多元二次回归方程，得出最佳实验条件。拟合结果表明，当反应时间 27.46h，噻吩浓度为 1.04%，微生物浓度 4.04%时，预测噻吩降解率为 14.8%，通过验证得最佳条件
2、下的降解率为 14.3%，与预测值相符。关键词 生物脱硫，噻吩，响应面设计Study on characterization of efficient desulphurization bacterium by response surface methodologyZhang Xiuxia Kong Tiantian Chen Shuiquan Wang Zhiwei Shao Jun Liu Xinmei（Department of Environmental and Safety Engineering, China University of Petroleum, Qingdao 26
3、6580, China）Abstract A strain of bacterium named S-4 which can degradate thiophene was enrichment cultured and selected from high sulfur polluted activated sludge，and the morphological characteristics of the strain were observed as well. The software Design-Expert 8.0.5b was applied to the response
4、surface optimization experiment. And the influence of three factors which were reaction time， concentration of thiophene and concentration of microorganism was studied in the process of desulphurization bacterium S-4 degradation . The optimum experimental conditions and an equation were achieved by
5、the software. The optimum reaction conditions were determined as follows: reaction time 27.46h, concentration of thiophene 1.04%, concentration of microorganism 4.04%. Under these conditions, the maximum theoretic thiophene degradation rate was 14.8%. After verifications, the maximum theoretic value
6、 was consistent with mean value of verification test, which was 14.3%. 收稿日期：2012-基金项目：中央高校基本科研业务费专项基金（10CX05010A ）和青岛市科技计划（ 11-2-4-4-(12)-jch）资助。作者简介：张秀霞（1966） ，女，教授，从事水污染控制及回用技术，固体废物资源化处理技术研究， 。Key words:microbial desulphurization; thiophene; Response surface methodology随着环境保护观念的日益深入人心，低硫甚至无硫清洁燃料油成
7、为世界燃料油生产的必然趋势 1。近年来全球范围内油品(汽油、柴油) 的使用量不断增大，油品燃烧后产生的废气对环境的危害也日趋严重，如何有效地脱除油品中的硫成为人们的关注焦点 2。燃料油中的硫少量以元素硫、硫酸盐以及硫化氢存在，大部分以硫化物、硫醇、噻吩、苯并噻吩或者二苯并噻吩等有机硫存在 3，因此，噻吩类硫化物的脱除成为油品脱硫的重中之重。目前常用的加氢脱硫法( Hydrodesulufurzation ,HDS)，需要在高温高压下进行，能耗高，且很难脱除石油中的杂环类有机硫化物，如噻吩类硫化物、二苯并噻吩等，愈来愈难以满足环保的要求 4。微生物对噻吩等杂环类含硫化合物进行高效脱硫可以克服上述
8、不足 5。微生物脱硫(Biodesulfurization,BDS)是近50年来发展的一种新型石油脱硫技术，它是利用微生物产生的酶选择性地将油品中含硫化合物，转化为水溶性硫化物，然后油水分离，以实现油品脱硫的目的 6。目前国际上公认的具有脱硫能力的微生物有十多种，例如好氧菌Rhodococcus sp.7、Mycobacterium sp. 8-9、Pseudomonas sp.10、Gordona sp. 11等；厌氧菌Paenibacillus sp.12等。微生物脱硫技术的发展将集中在以下3个方面：(a)高效功能菌的筛选及培养。随着分子生物学技术的快速发展，可以运用基因工程的手段，分离出
9、负责细菌脱硫活性的基因，并将这些功能基因通过重组，克隆并构建具有脱硫功能的高效基因工程微生物菌种 13。(b)微生物对硫代谢途径的控制研究。目前已知的代谢途径主要是Kadamant途径和4S途径 14，然而对某些菌种的脱硫机理还不太清楚，故而研究微生物脱硫的代谢反应机理，使微生物代谢硫的产物更易从反应相中分离，或将代谢物固定在相中将是决定微生物脱硫技术能否得到市场认可的关键 15。(c)关于复合微生物脱硫技术的研究。我们可以通过菌种的配伍性筛选，从而获得具有复合脱硫功能的微生物菌种 15。响应面分析法是20世纪中后叶发展起来的优化试验条件方法 16，该方法采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值
10、之间的关系，对影响产量的各因子水平及其交互作用进行优化评价，并求出最佳值 17。由于其能用较少的实验数据推算出目标值的优化条件，优化效率高，在微生物方面应用广泛 18，近年来响应面分析法越来越多的被应用到脱硫菌的性能研究方面 19。本实验从高硫污染的活性污泥中富集培养，分离纯化得到一株可以在以噻吩为唯一硫源的基础盐培养基生长的菌株，对其进行了形态测定，以石油中含量相对较高、难于降解的典型有机杂环硫化物噻吩(Thiophene)为模型化合物，采用响应面设计法研究反应时间、微生物量、噻吩浓度3个因素对脱硫效果的影响，以期对油品中噻吩类化合物的去除提供参考。1 材料与方法1.1 菌种脱硫菌为本实验室
11、从活性污泥中分离出五株以噻吩为唯一硫源生长的脱硫细菌，通过碳源利用性试验及噻吩降解试验，筛选出一株降解率最高，性能最好的菌株S-4。1.2 试剂噻吩(Thiophene)：纯度99% ，购自阿法埃莎（天津）化学有限公司公司；其他试剂均为化学纯，购自国药集团化学试剂有限公司。1.3 培养基基础盐培养基( Basic salt medium，BSM ) ：K 2HPO43H2O 4 g，NaH 2 PO42H2O 4 g，NH 4Cl2 0.1g，MgCl 26H2O 0.2g，CaCl 22H2O 0.001 g， FeCl36H2O 0.001 g, 甘油2 g；噻吩培养基：在BSM 培养基中
12、加入噻吩作为唯一的硫源； 碳源利用培养基： BSM 培养基中的碳源由甘油替换成十二烷、十六烷、石蜡和萘等; 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏10g，蛋白胨5g，NaCl 5g，H 2O 1000mL。1.4 脱硫菌的筛选采集活性污泥，经稀释后接种到在噻吩固体培养基上，反复划线纯化，制得单菌落，并接种在斜面培养基上，保存备用。1.5 含硫量的测定在50mL基础无机盐培养基（加噻吩）中，加入500L甘油，并接入适量脱硫菌，30，120 r/min摇床培养24h后，取样分析。空白试验为无机盐培养基中只加噻吩，不接菌。每组实验均做3次平行试验，取平均值做为其中的硫含量 20。取50mL苯于待测溶液中，置
13、于140rpm的摇床中10min后取出，静置，待分层后用移液枪移取上层液500L于25mL容量瓶中，用同批次苯定容，取1mL加入加有10mL 硫酸铁- 硫酸溶液和2mL 吲哚醌-三氯甲烷溶液的磨口比色管中，另取1mL苯加入加有10mL硫酸铁-硫酸溶液和2mL 吲哚醌-三氯甲烷溶液的磨口比色管中，震荡10min ，在15 25下放置60min。将显色的硫酸层移入0.5cm比色皿中，用加入苯的比色试管中的硫酸层作参比溶液，在分光光度计上于最大吸收波长590nm 处测其吸光度。根据吸光度计算噻吩的浓度。根据下式计算噻吩的降解率。 %100C-噻吩降解率，%；C1-处理后剩余噻吩浓度，mL/50mL；
14、C0-处理前体系中的噻吩浓度，mL/50mL。1.6 细菌的碳源利用性考察菌株在十二烷、十四烷、十六烷、石蜡和萘为碳源的基础无机盐培养基中的生长情况。若菌株在以上述烃类作为唯一碳源的培养基上几乎不能生长，说明该菌符合生物催化脱硫的基本条件，脱硫不会损失燃料燃烧值 21。其中，正十二烷、正十四烷和正十六烷代表燃油中不同长度的直链烷烃，液体石蜡代表有支链的饱和烷烃，萘代表不饱和芳烃。1.7 微生物生长曲线的测定将筛选出的细菌在无菌操作下取 5mL 接到装有 50mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，将接入细菌的 15 个锥形瓶置于 30、120rpm 的摇床中，分别隔0h、1h、2h、3h、4h、6h、
15、8h、10h、12h、14h、16h、18h、21h、24h、27h、30h、32h、33h 后用 721 分光光度计在最大吸收波长 600nm 下以未接入细菌的相同培养基为空白测定细菌的光密度 OD600。以时间为横坐标，细菌光密度 OD600 为纵坐标做细菌的生长曲线。2 结果与分析2.1 高效脱硫菌的筛选2.1.1菌落的形态特征取活性污泥，采用平板划线分离法从活性污泥中筛选高效脱硫菌，经过筛选驯化，分离筛选出 5 株单菌，编号为 S-1、S-2、S-3、S-4、S-5，这 5 株脱硫菌的菌落特征见表 1。表 1 筛选菌株形态特征Table 1 Characteristics of str
16、ains菌株 菌落颜色 菌落特征S-1 黄色 圆形，边缘规则，表面光滑，菌落小而凸起S-2 橙色 圆形，边缘规则，表面光滑，菌落小而凸起S-3 白色 圆形，边缘不规则，表面不光滑，菌落较大S-4 乳白色 圆形，边缘规则，表面光滑，菌落小而凸起S-5 灰白色 圆形，边缘不规则，表面粗糙，菌落扁平2.1.2 细菌碳源利用性测定实验考察菌株在正十二烷、正十六烷、石蜡和萘为碳源的基础无机盐培养基中的生长情况。实验测定 OD600，结果见表 2。表 2 碳源利用性测定结果Table 2 The result of carbon source utilization菌株编号碳源S-1 S-2 S-3 S-
17、4 S-5正十二烷 0.015 0.028 -0.006 0.014 0.071萘 0.009 0.042 0.076 0.021 0.128正十六烷 -0.027 0.037 0.057 0.013 0.180石蜡 -0.008 0.045 0.067 0.010 0.202由表2可以看出，菌株S-2，S-3和S-5的光密度偏大，说明这3种菌在以正十二烷、萘、正十六烷和石蜡为碳源的培养基中能够生长，即能利用这些碳源；而S-1，S-4这两株菌的光密度较小，说明这两种菌株在以上述烃类作为唯一碳源的培养基上几乎不能生长，符合生物催化脱硫的基本条件，脱硫不会损失燃料燃烧值 21。2.1.3 噻吩降解
18、率的初步测定为了考察 5 株菌对噻吩的降解情况，将 5 株菌分别接入到在摇瓶培养基中培养 24h，测定噻吩的降解率。实验结果表明，5 株菌对噻吩均具有降解能力，在培养 24h 后菌株 S-2、菌株 S-3、菌株 S-4、菌株 S-5 对噻吩的降解率分别为 41.6%、41.1%、42.8% 、47.0%，菌株1 对噻吩的降解率仅为 8.1%，空白值为 0.3%。根据噻吩降解率和碳源利用性实验的结果，最终选择菌 S-4 作为高效降解菌，用于后续实验。2.1.4 细菌生长曲线测定根据所测光密度 OD600 与时间的关系，绘制出的菌 S-4 的生长曲线见图 1。0714212835.0.51.01.
19、5 OD6反 (h)图 1 菌 S-4 的生长曲线Fig.1 The growth curve of the strain S-4由图 1，菌株 S-4 在 05h 为适应期，513h 达到对数生长期，1327h 之间为稳定期，27h 后开始进入衰亡期。了解菌种的生长周期，对微生物的固定化来说非常重要。对该菌进行脱硫实验时，应选择对数生长期和稳定期交界点（13h）的菌液为种子液，以保持其最高活性和稳定性。2.2 高效脱硫菌的性能测定考察反应时间、微生物量、噻吩浓度等单因素对细菌脱硫性能的影响。2.2.1 单因素实验设计单因素实验，考察各因素对细菌降解性能的影响。（1） 反应时间的影响50 mL
20、摇瓶基本培养基中加噻吩0.5mL(噻吩的初始浓度为 0.5mL/50mL)，甘油500L，细菌接种量2mL，以不接入细菌但其他条件相同的试样作空白，于30、140rpm摇床培养。分别在5h、10h、12h、20h、24h后测定不同时间下菌株对噻吩的降解率。其结果如图2所示。10203040504681012 反 (%)反 (h)图2 反应时间的影响Fig.2 Effect of reaction time从总体上看，随着时间的增加，菌 S-4 对噻吩的降解率是逐渐增大的，但是 24h 以后降解率增大的幅度逐渐减小，最终选择 24h 做为最佳降解时间。（2） 微生物量的影响50mL 摇瓶基本培养
21、基中加噻吩 0.5mL(噻吩的初始浓度为 0.5mL/50mL)，甘油 500L，细菌接种量分别为 1mL、2mL、3mL、4mL 、5mL，以不接入细菌但其他条件相同的试样作空白，于 30，140r/min 下摇床培养，24h 后测定不同微生物量下菌株对噻吩的降解率。其结果如图 3 所示。2468108.9.0.29.4.69.8 反 (%) 反 (%)图3 微生物量的影响Fig.3 Effect of microbial biomass 由图 3 可知，随着微生物量的增加，降解率总体呈上升的趋势，但是当微生物量大于4%后，上升趋势缓慢，降解率差异小于 1%。原因可能是菌液接种量少时，营养充
22、足，菌液与噻吩充分接触，虽降解不够完全，但降解速度快；接种量过多时，营养物不足，菌种之间相互竞争，导致降解速度相对降低。故选择 4%为最佳微生物量。（3） 底物浓度的影响在 50mL 基础无机盐培养基中加甘油 500L，分别加入0.3mL、 0.4mL、0.5mL 、0.6mL 、0.7mL 无菌噻吩，细菌接种量 2mL，以不接入细菌但其他条件相同的试样作空白，于 30，140r/min 下摇床培养， 24h 后测定不同底物浓度噻吩下菌株对噻吩的降解率。其结果如图 4 所示。0.60.81.01.21.468101214 反 (%) 反 (%)图 4 底物浓度的影响Fig.4 The infl
23、uence of substrate concentration由图 4 可知，当噻吩浓度小于 1%(v)时，随着噻吩量增加，其降解率也随之增大；当噻吩量大于 1%时，随着噻吩量增加，其降解率随之减小。当噻吩量为 0.5ml 时，降解率最高。原因是，随着噻吩量增大，其毒性抑制微生物的活性，导致降解率不高。所以选择最佳底物浓度为 1%。2.2.2 响应面设计采用响应面设计方法，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，寻求最优工艺参数。通过单因素实验确定了3个参数的中心点，设计响应面确定最优工艺参数。响应面设计因素水平设计见表3。表 3 响应面设计因素与水平Table 3 The f
24、actors ang levels of response surface水平因素 -1 0 1 A（反应时间/h） 12 24 36B（底物浓度/%） 0.8 1 1.2C(微生物浓度/%) 2 4 6以 A（反应时间） 、B（底物浓度） 、C (微生物浓度)为自变量, 以噻吩降解率为响应值( J) , 进行响应面分析试验, 结果见表 4。表 4 响应曲面优化实验数据Table 4 The experimental data of reponse surface编号 时间/h 底物浓度/%微生物浓度/% 预测降解率/% 实测降解率/%1 12 1.2 4 6.95 5.792 24 1.0
25、4 14.28 14.283 24 1.0 4 14.28 14.284 24 0.8 6 8.83 7.035 24 1.0 4 14.28 14.286 24 1.0 4 14.28 14.287 36 1.2 4 13.80 13.198 36 1.0 2 12.39 11.29 12 1.0 6 8.06 9.2510 24 1.2 6 9.93 9.911 24 0.8 2 9.14 9.1712 24 1.0 4 14.28 14.2813 12 0.8 4 8.68 9.2914 36 1.0 6 14.59 15.2315 24 1.2 2 10.98 12.7816 12 1
26、.0 2 11.63 10.9917 36 0.8 4 9.11 10.272.2.2.1多元二次回归方程的建立及显著性检验利用软件Design expert 8.0.5b对Box-Behnken试验结果进行二次多项回归拟合，获得噻吩降解率对反应时间A、微生物浓度 B和底物浓度C的多元二次回归方程：J=14.28+1.82A+0.74B-0.34C+1.60AB+1.44AC-0.18BC-1.35A2-3.30B2-1.26C2 （2）J：降解率，%；A：反应时间，h；B：底物浓度，%；C：微生物浓度，% 。表 5 回归模型的方差分析Table 5 ANOVA of quadratic po
27、lynomial model变异来源 平方和 自由度 均方 F value P 值模型 115.92 9 12.88 6.67 0.0102失拟项 13.51 3 4.50误差 0.00 4 0.00残差 13.51 7 1.93总和 129.43 16表 6 回归方程系数显著性检验结果Table 6 Significance test for regression coefficients of quadratic model因子 回归系数 标准误差 P 值A 1.82 0.49 0.0076B 0.74 0.49 0.1796C -0.34 0.49 0.5096AB 1.60 0.69
28、0.0541AC 1.44 0.69 0.0765BC -0.19 0.69 0.7977A2 -1.35 0.68 0.0866B2 -3.30 0.68 0.0018C2 -1.06 0.68 0.1042通过表5回归模型方差分析和表6系数检验知道,模型决定系数R 20.8956，说明预测值和实测值之间的相关性很好；由表5可知：模型的F=6.67， P0.500，表明实验所采用的模型是极为显著的。由表6回归系数的显著性检验可知，因素A对噻吩降解率的线性效应均显著，B、C 对噻吩降解率的线性效应不显著；因素A 、B 和C对噻吩降解率的曲面效应均显著；因素B 、C对噻吩降解率的两两交互影响不显
29、著，A 、B 和A、C 之间对噻吩降解率的交互影响均显著。2.2.2.2 响应面分析及最优培养基成分和培养条件的确定借助软件Design expert 8.0.5b软件依据回归方程来绘制响应曲面图，考察所拟合的相应曲面的形状。曲面立体图见图5。影响菌株 S-4 降解噻吩的各因素及其相互作用的响应面如图 5 所示。图 5（a）是反应时间与噻吩浓度对噻吩降解率的影响。可以看出，随着降解时间的增长，噻吩浓度接近 1%时，降解率较高，时间对降解率的影响更大。图 5（b）是微生物浓度与反应时间对噻吩降解率的影响。可以看出接种量越多，时间越长，接种量越高时，降解率就越高。图 5（c）是微生物浓度与噻吩浓度对噻吩降解率的影响。噻吩量为 1%，微生物浓度为 4%时，噻吩的降解率最高。两因素的交互不明显。综上所述，3 个因素太高或太低都不利于噻吩降解率的提高。通过软件 Design expert8.0.5b 拟合得到该模型的最佳工作条件为反应时间 A 为 27.46h，底物浓度 B 为1.04%，微生物浓度 C 为 4.04%，预计降解率 J 为 14.8%。2.2.2.3 模型验证在最优水平下模型的预测值为14.8%，为了验证模型的准确性，用最佳降解条件进行3次摇瓶降解试验，所得噻吩的平均降解率为14.3%，可见该模型能够较好地预测实际降解情况。
