1、酵母菌遗传,酵母菌概述,酵母菌：一种单细胞真菌，属于兼性厌氧菌；个体形态有球状、卵圆、椭圆、柱状和香肠状等。 酵母菌具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，酵母菌虽属于真核微生物，同时又具有原核生物的某些特征，例如形成菌落特征与细菌相似，生长速度快等。 1996年完成酿酒酵母全基因组的测序，是当时完成测序的最大基因组，也是真核生物中第一个被测序的生物。,一、酵母菌的基因组和染色体 二、酵母线粒体基因组及其遗传 三、酵母菌中的质粒 四、酵母基因表达的调控 五、接合型基因及其基因型转换 六、酵母菌的载体系统 七、酵母双杂交系统,第一节 酵母菌的基因组和染色体 一、
2、酵母菌的基因组,1. 酿酒酵母的单倍体细胞含有16条染色体，总长度为12068kb，其中第条染色体最短(230kb )，第条染色体最长(1532kb) 。2. 基因组中没有明显的操纵子结构，有间隔区和内含子。3. 酿酒酵母染色体基因组中，有5885个可能是编码蛋白质的ORF，每个ORF约为1.4kb，而基因间的平均间隔为600bp。（这说明酵母基因比其它高等真核生物基因排列紧密。）4.基因组含有52个完整的Ty因子（反转座子）。,第一节 酵母菌的基因组和染色体,1.核小体：DNA和组蛋白（H2A、H2B、H3和H4） 酿酒酵母中无H1（有丝分裂中维持染色质的高度超螺旋） 2.着丝粒（centr
3、omere）:点着丝粒和区域着丝粒 3.端粒(telomere)：末端重复序列和蛋白质 4.复制起点：控制DNA复制起始的一段DNA序列ARSARS若克隆到质粒中，可使质粒DNA在酵母中自主复制。1）ARS的结构A：ACS在所有的ARS都完全相同或相似ARS B：ACS的3末端C：A,1.着丝粒,概念着丝粒是真核细胞染色体DNA上的一段特殊序列。在有丝分裂和减数分裂时，纺锤丝与着丝粒结合，将染色体拉向细胞的两极。 主要类型：点着丝粒（着丝粒序列很短 酿酒酵母）区域着丝粒（着丝粒序列较长 脉胞菌、果蝇、人 ）,1.着丝粒,在酿酒酵母中，所有染色体的CEN序列的长度均大于130bp，由53依次分为
4、 CDE、CDE和CDE三个区。CDE和CDE是两个共有序列，位于两侧，中间是CDE，CDE的核苷酸序列中（A+T）含量超过90，所以容易弯曲。,2.端粒,端粒是真核生物线性染色体两端的特殊DNA-蛋白质复合体结构，这种复合体结构是由 DNA重复序列和与之相结合的蛋白质分子构成的。在大多数生物中，端粒DNA只是由几个碱基组成的DNA重复单位通过串联重复而形成，长度从20bp到几个kb不等。酿酒酵母端粒DNA的长度约为300bp，其DNA重复单位为：5C1-3A3G1-3T,在大多数生物中，端粒DNA的旁边还常含有由中等重复序列组成的DNA。 在酵母中，与端粒相连的DNA有两类：,X 保守性较差
5、，长度为0.33.7kb，存在于大多数染色体上。,Y 高度保守，长度为6.7kb,酿酒酵母中2/3的端粒含有14个拷贝的Y。,X和Y作用： 非必需，对端粒的稳定、染色体断裂后的修复以及在减数分裂中染色体联会方面都起辅助作用。,3.复制起点酵母的复制起点是指染色体上控制DNA复制起始的一小段DNA序列，通常称为自主复制序列(autonomously replicatory sequence，ARS)。自1979年首次发现酿酒酵母的ARS以来，已在酿酒酵母中约有400个ARS， ARS/40kb。但这些ARS的使用频率不同，变动在0-100%之间。,（1） 自主复制序列ARS的结构 酿酒酵母中，A
6、RS是长度为100200bp、富含 A T 的DNA片段。 根据其在质粒中的稳定性，可分为三个结构域：其中A和B最为重要,（2）ARS-结合蛋白 酿酒酵母复制的起始可能是通过蛋白质与ARS相互作用而引起的 。 与ARS结合的蛋白有六种，分子质量分别：120kD、72kD、62kD、57kD、53kD和50KD,这些蛋白以复合物的形式存在并与ACS结合，这种蛋白质复合体称为起始识别复合物（ORC）。 ORC与A区结合，也与B区结合。另外，Abflp也是一种主要的ARS结合的蛋白，能提高复制效率。,（3） ARS启动染色体复制的活性 酿酒酵母基因组中约有400个ARS，但并不是所有的ARS在原染色
7、体上都具有自主复制活性。可是，将这些染色体上的ARS克隆到质粒上后，却都有自主复制活性。从使用的时序来看，可分为两类：位于不同位点表现的活性不同，靠近端粒的ARS，一般不表现活性。,第二节 酵母线粒体基因组及其遗传,线粒体是真核细胞重要的代谢中心之一。线粒体DNA(mtDNA)编码线粒体自身所需的rRNA、tRNA以及某些蛋白质如细胞色素和ATP酶等。（一）呼吸缺陷突变株 酵母可以通过呼吸和发酵这两种代谢形式来取得能量，在有氧条件下呼吸，缺氧条件下发酵。 小菌落突变株：吖啶黄处理野生酵母后，出现很多在好气条件下生长缓慢的突变株。（缺少细胞色素a、b以及细胞色素c氧化酶）分离性小菌落：染色体上基
8、因发生了突变类型 中性小菌落：完全丢失了线粒体DNA抑制性小菌落：丢失了部分线粒体DNA,（二）酵母线粒体基因组的物理图谱及其特点,1.酵母线粒体DNA是周长约26m的环状DNA分子，其大小为84kb。 2.绝大多数的mtDNA中没有重复核苷酸序列。 3.线粒体是半自主性的，能复制并传递给后代，还能转录所编码的遗传信息，合成线粒体某些自身特有的多肽，但是并非自给自足。,第三节 酵母菌中的质粒,（一）2m质粒环状且周长为2m的DNA双链、50100个拷贝，只携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因（REP1、REP2、REP3和FLP），不赋予宿主细胞遗传表型，属于隐蔽质粒。,1.特征：质粒上有两个
9、600bp长的反向重复序列（IR），这两个IR中间由一个大单一区域和小单一区域所间隔。 2.在两个IR上各有一个FRT(专一性重组位点)，由于这两个FRT间的相互重组，产生A型和B型两种互变异构型的混合质粒。,（二） 嗜杀现象,1963年，Bevan和Makower发现酿酒酵母中某些菌株可产生毒素而杀死其他酵母的现象。嗜杀株（killer）：产生毒素的菌株敏感株：对毒素敏感的菌株中性株：既不产毒素又不敏感的菌株该特性由两种具有自我复制能力的细胞遗传因子-双链线状RNA(dsRNA)决定的，它们通常以蛋白质外壳包裹着的粒子状态存在于细胞之中，不具有体外侵染的特性。也称为类病毒颗粒（virus-l
10、ike particle）.分类：L型类病毒、M型类病毒L-dsRNA:编码自身和M型的蛋白外壳和RNA聚合酶M-dsRNA：编码杀伤毒素蛋白，分泌到细胞外。,第四节 酵母基因表达的调控,根据其性质，真核基因调控分两类: 1、瞬间调控（可逆性控制） 2、发育调控（不可逆性控制）,上游激活序列（upstream activating sequence UAS） TATA元件 转录起始位点 沉默子,一、酵母基因的启动元件（顺式作用元件）,二、酵母转录调控因子（反式作用蛋白）,通用转录因子结合在TATA序列附近，包括TFII-A、TFII-B、TGII-D、TFII-E、TFII-F等。 转录调控因
11、子（结合在启动子上游）转录调控蛋白由两个独立的结构域组成： （1）DNA结合区 （2）转录激活区,1.TATA 区结合蛋白,转录起始复合物由 TATA 元件附近序列及转录起始位点等顺式作用元件和多种通用转录因子及RNA聚合酶组成。成环假说,2.GAL4转录因子和gal基因的表达调控,酵母半乳糖代谢酶基因（gal）表达可以被生长条件所控制。半乳糖通过转化为6-磷酸葡萄糖后进入糖酵解途径而被酵母利用。gal基因的转录是被严格调控的。gal1基因、gal7基因、gal10基因和gal12基因在没有半乳糖的条件下不表达，而在半乳糖存在条件下表达水平提高约1000 倍。,3.GCN4转录调控因子GCN4
12、能特异结合到许多氨基酸合成酶基因的启动子调控元件上，激活基因的转录。,HAP1 HAP2和HAP3都是转录因子，控制酵母细胞色素c基因CYC1和CYC7的转录。 CYC1 UAS 由 UAS1 和UAS2 两个位点组成。UAS1 与葡萄糖抑制时基因的转录有关UAS1和UAS2共同作用 是乳糖去阻遏时基因转录所必需的。,4.HAP1 HAP2和HAP3,酵母细胞的单倍体类型是由接合型基因（MAT和MATa）决定的。MAT编码1和2两个蛋白调控因子，它们决定型细胞的表型。MATa编码a1蛋白，控制a型细胞的表型。,5.1、2和a1调节蛋白,一、酿酒酵母的生活史 二、酿酒酵母细胞分裂的遗传控制1、a
13、和单倍体细胞2、接合信息素信号的传递3、接合型基因MAT在接合过程中的调控作用 三、接合型基因的转换1、酵母接合型基因的结构2、接合型转换机理,第五节 接合型基因及其基因型转换,第五节 接合型基因及其基因型转换,一、酿酒酵母的生活史,一、酿酒酵母的生活史 二、酿酒酵母细胞分裂的遗传控制1、a和单倍体细胞2、接合信息素信号的传递3、接合型基因MAT在接合过程中的调控作用 三、接合型基因的转换1、酵母接合型基因的结构2、接合型转换机理,第五节 接合型基因及其基因型转换,第五节 接合型基因及其基因型转换,二、酿酒酵母细胞分裂的遗传控制,酵母的有性生殖取决于两个单倍体细胞的接合型，其接合型的“性别”
14、是由其本身的遗传物质所决定的，是稳定的遗传特征。,1、a和单倍体细胞,第五节 接合型基因及其基因型转换,二、酿酒酵母细胞分裂的遗传控制,细胞分泌的-因子与a细胞中ste2基因编码的受体蛋白结合。同样，a细胞分泌的a-因子与细胞中ste3基因编码的受体蛋白结合。,2、接合信息素的传递,第五节 接合型基因及其基因型转换,二、酿酒酵母细胞分裂的遗传控制,2、接合信息素的传递,第五节 接合型基因及其基因型转换,二、酿酒酵母细胞分裂的遗传控制,2、接合信息素的传递,在酿酒酵母中，磷酸化的转录因子Ste12是一个控制不同发育过程起始的转录调节因子。在单倍体细胞中，Ste12通过阻遏单倍体细胞特异性基因的表
15、达和促进与接合有关的必需基因的表达，从而促进接合所需的生理反应，最终形成合子；在双倍体细胞中，Ste12是细胞生长所必需的。,第五节 接合型基因及其基因型转换,二、酿酒酵母细胞分裂的遗传控制,3、接合型基因MAT在接合过程中的调控作用,酿酒酵母的单倍体细胞a和两种接合型, 分别是由MATa和MAT基因决定的。MAT编码1和2两种调节蛋白。1蛋白激活sg基因群的表达，而2是一种同源结构域蛋白, 阻遏性地抑制asg基因群的表达，因此, 在MAT细胞中表现出型细胞的表型性状。MATa也编码a1和a2两种蛋白，但a2蛋白的功能不清楚，与接合作用的调控无关；a1蛋白在单倍体细胞中不起作用，只在二倍体细胞
16、中起作用。在a型细胞中,asg基因群可组成型地表达, 表现出a型细胞的表型性状。,第五节 接合型基因及其基因型转换,二、酿酒酵母细胞分裂的遗传控制,3、接合型基因MAT在接合过程中的调控作用,（1）当a和细胞接合形成a/二倍体细胞后，细胞内的接合型基因以MATa/MAT二倍体的形式存在。(2)MAT生成的2蛋白抑制asg基因群的表达，同时2和a1蛋白协同作用阻碍1和所有hsg基因群的表达。(3)因此细胞不再具备接合能力, 而是激活二倍体特异性基因的转录, 同时信息素的信号系统也终止。(4)二倍体细胞在营养条件不良时,进行减数分裂以产生子囊孢子。,第五节 接合型基因及其基因型转换,三、接合型基因
17、的转换,1、酵母接合型基因的结构,a可以转变成型, 型也可以转变成a型。这两者可以相互转变的现象称为接合型转变(mating type conversion)。这些品系带有显性等位基因 HO 并频繁地改变它们的交配型（常常每代改变一次），带有隐性等位基因 ho 的品系有一个稳定的交配型，其交配型改变的频率仅约 10 -6 。接合型转换的存在表明所有的细胞都含有称为MATa和MAT所需要的信息，但是只有类型获得表达。,第五节 接合型基因及其基因型转换,三、接合型基因的转换,1、酵母接合型基因的结构,为什么会出现接合型的转变呢？接合型基因MAT的两侧有两个沉默基因座位HML和HMLa，它们与MAT
18、位于同一染色体上，与MAT的距离分别是180kb和150kb。HML和HMR含有与MAT相同的交配型基因，但只有MAT座位的基因才组成型的表达，而HML和HMRa不表达。,第五节 接合型基因及其基因型转换,三、接合型基因的转换,1、酵母接合型基因的结构,1.在两个沉默基因座位HML和HMR的两侧各有抑制表达的沉默子，位于HML上游的沉默子（EL）和下游的沉默子（IL），位于HMR上游的沉默子（ER）和下游的沉默子（IR）。沉默子对基因的表达起负调控作用，即抑制基因的表达。2.SIR1、SIR2、SIR3、SIR4这几种蛋白通过与E位点的相互作用而抑制基因的转录。E的行为类似于负增强子，可在离启
19、动子2.5kb远距离行使功能，且无方向性。活跃基因上无E位点和I位点。,第五节 接合型基因及其基因型转换,三、接合型基因的转换,2、接合型转换机理,接合型的转换说明发生了基因转变，这种转变是由于受体位点MAT的Y或Ya被位于同一染色体上的HMR中的Ya或HML中的Y序列所取代而完成的。这种基因转换是由HO内切酶所引起的。HO内切酶只对MAT的Y区右侧的Y-Z交界处进行识别和切割，HO内切酶引起的双链断裂，激发了MAT序列的转换过程，这种转换实际上是一种重组过程。,第六节 酵母的载体系统,根据其功能可分为三大类：克隆载体表达载体分泌载体转化方法：电转化法醋酸锂法,一、克隆载体,1、酵母整合型载体
20、（YIp)2、酵母附加体质粒载体（YEp）3、酵母菌复制载体（YRp)4、酵母着丝粒载体（YCp)5、酵母人工染色体（YAC),1酵母整合型载体（YIp）,1. 这类载体只含有大肠杆菌的复制起点, 不能在酵母菌中自主复制。但可以与酵母染色体进行同源重组, 以低频率整合到酵母细胞染色体上。2. 整合位点数取决于载体中的互补基因序列数。通常以单拷贝存在, 少数发生多位点整合。3. 大部分YIp质粒含酵母菌选择标记(如HIS3、LEU2、URA3等)。4.这种质粒的转化子很稳定,可在无选择条件下培养很多代而不丢失,但其转化率很低,2酵母附加体质粒载体（YEp）,载体的拷贝数多（50100）、稳定性好
21、，是酵母遗传工程中应用最广泛的载体系统，常用于酵母菌中的一般基因克隆和基因表达的研究。,3酵母菌复制载体(YRp),Yrp含有酵母自主复制序列（ARS），可作为染色体外因子复制并保留下来。这类载体转化率高，拷贝数也高，但在减数分裂和有丝分裂中不稳定而使群体内的拷贝数变化很大。,4酵母着丝粒载体(YCp),1.含有酵母染色体的着丝粒（CEN），在细胞分裂时新复制的质粒均等分离，每一个细胞得到13个质粒，故拷贝数很低，但很稳定。 2.由于YCp的高稳定性和低拷贝数，因此这类质粒适合做亚克隆载体和构建酵母基因组DNA文库 3.还可用于检测有丝分裂中染色体倍性变化和分析鉴定酵母基因突变等研究。,YAC
22、载体的使用：,一些哺乳动物的基因大于100kb超过了大肠杆菌载体系统的承受范围，但正好在YAC载体的范围之内。研究发现，在某些情况下，YACs可以在哺乳动物中表达，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能。 YACs在构建基因文库中非常重要，最高容量的大肠杆菌质粒可以插入300kb的片断，对于人的基因文库需要30000个克隆，而YACs可以克隆600kb的片段，一些类型可以携带1400kb片段，可以使人类基因文库的克隆数降至6500个。虽然，”mega-YACs”存在着不稳定性，克隆的DNA片段可以被重新排列。但是，YACs在大规模的测序中是非常有用的。,YAC(yeast artificia
23、l chromosome)是人工构建的具有酵母染色体功能的人工染色体载体。1983年Murray等人将酵母的着丝粒、自主复制序列及一些标记基因与四膜虫大核 rDNA末端的端粒连接在一起，共同构成了长度为55kb的酵母人工染色体。1987年，美国华盛顿大学的Burke等人构建了能克隆大片段的酵母人工染色体，这是真正意义上的第一代 YAC载体系统。,5酵母的人工染色体(YAC),酵母的表达载体包括酵母菌的强启动子、多克隆位点、终止子。外源结构基因插入多克隆位点的适当酶切位点，在强启动子的调节下，外源基因就可进行高效表达。酵母启动子分两大类： 第一类是来自编码解糖酶基因的解糖启动子，如ADHI、PG
24、K、GAP、ENOI等，这些启动子能在酵母菌中高水平组成型表达； 第二类是强调节启动子，其中GAL1、GAL7和GAL10是半乳糖调节启动子。,二、酵母菌的表达载体(YXp),分泌载体是一种将基因产物分泌到胞外的一类载体。酵母菌的分泌载体除必须含有表达载体的启动子和终止子外，还需要在表达载体的起始密码子(ATG)的上游有分泌信号序列。,三、酵母菌的分泌载体(YSp),第七节 酵母双杂交系统,1.作用：酵母双杂交系统是研究酵母体内蛋白质-蛋白质相互作用的一种方法。 2.原理： gal4基因编码的GAL4是酵母半乳糖代谢酶基因（gal）转录必需的转录激活蛋白质。 GAL4包含两个可分割的、功能相互
25、独立的结构域 (1)DNA结合结构域(DNA-BD):：能识别和结合到启动子的上游激活序列； (2)转录激活结构域(DNA-AD) ：通过同RNA聚合酶相互作用，启动UAS下游的基因进行转录。这两个结构域分开时仍各自具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性。,（一） 酵母双杂交系统原理,在酵母双杂交系统中，将两个待测蛋白X和Y分别于DNA-BD结构域和DNA-AD结构域融合。1.如果 X和Y没有相互作用，不能激活UAS下游报告基因的表达。2.如果X和Y存在相互作用，可激活UAS下游报告基因的表达。,（一） 酵母双杂交系统原理,
26、用酵母双杂交系统研究两个蛋白质之间的相互作用时，首先将X和Y的基因分别克隆到AD和BD两个质粒载体中，构建两个重组质粒，然后将两个重组质粒共同导入酵母细胞中，从而实现在同一个酵母细胞中同时表达两个融合蛋白。因此，完整的酵母双杂交系统由三部分组成：AD载体、BD载体和带有报告基因的酵母菌株。,将AD结构域克隆到另一个酵母表达载体上，构建成和 pGAD-C（X）质粒, 称为目标质粒（Pray plasmid）,将BD结构域克隆一个酵母表达载体上，构建成pGBD-C(X)质粒，称为诱饵质粒（Bait plasmid）,SC-Try-Lue-His- X-gal,能生长，且为兰色菌落,1.酵母PJ69
27、-4A菌株本身无报告基因转录活性。2.这些启动子都受完整GAL4蛋白的诱导后可以高效表达。另外，该菌中的gal4基因被缺失，这样报告基因的表达完全依赖于表达载体所提供的GAL4 AD 结构域和BD 结构域在空间的互相靠近。,不能生长，即使生长也是白色菌落,SC-Try-Lue-His- X-gal,1. 有很高的灵敏性，可以检测到生物化学方法检测不到的相较弱及暂时的蛋白质间的相互作用。 2. 酵母双杂交系统是直接在细胞内表达融合蛋白，减少了人工纯化蛋白质的繁琐步骤。 3. 酵母双杂交系统是在活细胞内进行，蛋白质相对于体外更可能处于天然状态，因此更能代表细胞内的真实情况。 4. 融合载体可以进行各种修饰以利于后续工作中确认蛋白质间的相互作用。如BD和AD载体各自带上不同的表面抗原标记以方便地用这些抗原的抗体来鉴定蛋白质。,二、酵母双杂交系统的特点,三、 酵母双杂交系统的应用,酵母双杂交系统主要用在两个方面： 研究两个蛋白质之间的相互作用； 筛选与已知蛋白质有相互作用的新基因。,THANK YOU,
