1、层析工艺验证,简介 层析验证的先决条件 工艺风险评估 原材料 工艺特性研究 分析方法 微生物负载和内毒素控制 研发和特性研究文件 层析柱工艺验证 一致性批次：生产规模验证 小规模验证研究 验证文件 后验证活动 持续监测和维护 变更控制,目录,定义：层析工艺验证是证明层析柱分离工艺能始终如一的按照批准的方案、既定的操作参数执行。,简介,简介,以上是理想状态，不同项目的活动和顺序是可变的,简介,工艺风险评估 工艺开发和特性研究的早期阶段：风险评估可将资源集中在最有可能对产品质量带来风险的操作参数或杂质。 工艺开发和特性研究的后期阶段：风险评估促使工作有条不紊。 规模放大：回顾所有操作参数和范围，评
2、估和确认潜在风险，识别缺失数据。风险评估结果可能指出需要额外的特性研究。 工艺开发和特性研究完成后，关键步骤过程控制知识建立后：识别和分级潜在工艺风险，必要情况下，可开发一个降低风险的措施。,层析验证先决条件,原材料 建立原材料质量标准和供应商变更控制程序。 正式工艺验证之前，原材料应经过确认。 层析填料有一些独特因素：通常是单一来源，很少有备用填料能执行同一功能，没有法定标准，对工艺结果有极高的影响。 层析不应采用动物源性的原材料。,层析验证先决条件,工艺特性研究 目的：建立工艺知识，包括可接受范围、设计空间、失败边缘。 工艺特性研究要获取设定范围内的工艺操作参数（输入）是如何影响工艺性能（
3、输出）的，据此鉴定关键操作参数、定义目标设定点和可接受范围。 工艺特性研究主要采用小规模研究。通过各种统计学方法设计实验，以更少的实验获得更多的数据。,层析验证先决条件,工艺特性研究 在项目开发的早期阶段（如临床I期前），可以只开发层析步骤，不定义最佳操作范围。当产品即将获得许可，再来优化生产的操作参数。 特性研究的基础：设备和设施的能力、已开发的工艺、理论知识、以往经验、供应商建议、文献、生产历史。,层析验证先决条件,工艺特性研究 特性研究应集中于影响层析性能的参数。例如，在离子交换操作，应评估上样蛋白的pH和离子强度、冲洗和洗脱条件、上样载量的影响。其他运行参数的范围（例如，温度、装柱情况
4、、或清洗条件），可能对工艺性能的影响较小。它们也应进行测试，以建立一个稳定的工艺。,层析验证先决条件,工艺特性研究 最终选定的范围应该跨越设备的已知变化和偏离。 参数的相互作用，可能会对性能产生多因素的影响，使用实验设计（DOE）方法可进行有效地测试。,层析验证先决条件,小规模模型 如何证明小规模和生产规模的等效性？ 通常通过在既定参数下多次运行并比较结果来实现。 评估影响工艺一致性的参数，如收率、洗脱图谱、洗脱体积和/或保留时间 评估代表产品质量的参数，如样品纯度、工艺相关和宿主细胞相关杂质的水平。,层析验证先决条件,层析验证先决条件,举例：疏水层析，小规模和生产规模输入参数比较,操作参数的
5、识别和分级 为了建立低风险的工艺控制策略并将验证集中于保持产品质量，把操作参数分为四类：,层析验证先决条件,层析验证先决条件,工艺稳健性 定义：工艺稳健性是指工艺在一个较宽的操作范围下，能始终如一且可靠地生产出符合预定指标的产品。一个稳健的纯化工艺不受内源性变化的影响。,层析验证先决条件,内源性变化 由于细胞培养/发酵的生物差异，原料会变化。这会导致产品效价、质量和宿主细胞杂质水平、或工艺相关杂质（细胞培养基成分）等的变化。 样品长时间存放也会导致产品变化。 围绕设定点波动的动态工艺控制也会带来变化。 在极端条件下（由特性研究确定）运行，结果会有极大差异。,层析验证先决条件,在定义工艺设计空间
6、时，要考虑以下几点： 原料差异性 工艺差异性 工艺相关杂质 最差情况工艺能力,层析验证先决条件,原料差异性： 为了有效的评估正常发酵/细胞培养差异性（效价、产品变异、宿主细胞杂质、工艺相关杂质、粘度）的影响，可能的话要测试多批原料。,层析验证先决条件,工艺差异性： 一些工艺条件和保存时间会影响产品质量。例如，蛋白A采用亲和层析，低pH洗脱可能会导致样品发生聚合，或是离子交换层析时高pH可能会导致样品大量脱氨化。在这两种情况中，必须证明在保存期限内，下游工艺步骤可以将这些变异体降低至可接受水平。,层析验证先决条件,工艺相关杂质： 工艺相关杂质可能来自发酵（比如核酸、抗生素）或来自下游工艺（比如蛋
7、白A配基脱落，缓冲液组分）。检测这些组分的去除，要采用上述研究的物料。另外，还可以进行掺标研究，特别是分析方法不适用或不够灵敏时。,层析验证先决条件,最差情况工艺能力： 指在正常操作范围内处理极端原料，或者在最宽的可接受范围内处理正常原料。,层析验证先决条件,分析方法 纯化的目的是去除工艺相关杂质、产品相关杂质和污染物。因此在层析验证研究中使用的分析方法应当能够可靠的检测和定量这些物质在不同缓冲体系中的预期范围。要适当控制这些方法以保证结果可靠。用于特定时期的分析方法，比如验证研究，应证明它们适用于预期目的（比如灵敏度、线性、精度、准确度）来确认。用于日常检测的分析方法也应验证,层析验证先决条
8、件,微生物负载和内毒素控制 层析步骤一般不在无菌条件下进行，因此必须适当控制微生物负载。在选择填料、清洗液、保存条件和工艺设备时,必须考虑生物负载控制。一旦有微生物（比如芽孢子类细菌）繁殖，填料将很难消毒。因此工艺设计时要避免引入微生物污染，这是很重要的。额外的控制并不少见。,层析验证先决条件,微生物负载和内毒素控制 通常，柱子使用后经消毒再用抑菌剂保存。产品和平衡液的制备和储存应尽量减少微生物的引入。层析系统的设计应有助于生物负载控制，比如，必须避免不必要的仪表、阀门和死体积。在工艺开发时，必须确定有效的柱子消毒程序，在生产规模一致性批次时进行确认，并且在日常工艺中监测。,层析验证先决条件,
9、研发和特性研究文件 经批准的研究文件是工艺验证方案的基础。研发和特性研究活动应该按照公司的政策进行记录、审核、批准。这些文档必须全部都能追溯到原始数据。转让文件（比如从研发者转让给商业操作者）可以参考这些信息，研究报告必须总结早期研究成果并描述工艺原理。这些研究可作为工艺特性研究的出发点。工艺特性研究要按照质量部依据公司政策批准的方案执行。 。,层析验证先决条件,验证研究的规模,层析柱工艺验证,当有类似设备或步骤，大部分公司会根据单元操作进行验证。另一种方法是依据前验证的数据进行模块化验证。每个单元操作都应该单独考虑。设计验证研究时，要考虑每个单元操作的功能。,层析柱工艺验证,一致性批次：生产
10、规模验证 在一致性批次研究开始前，要建立有操作参数的批生产记录并通过批准。这些操作参数来源于研发实验、特性研究以及早期的临床生产经验。 一致性批次生产的指标和范围通常和商业化批次一样。他们的主要目的是，在生产环境下，工艺符合可接受标准。一致性批次生产时，取样和分析都要在验证方案中定义。数据要记录，在报告中分析，并与可接受标准进行比较。验证报告也要分析偏差，以及和验证方案或批生产记录不符合的地方。,层析柱工艺验证,一致性批次通常要进行以下研究： 操作参数控制 层析柱性能控制 杂质去除 微生物负载和内毒素控制 层析柱清洗和再生 保存,层析柱工艺验证,操作参数的控制 一致性批次生产时，操作参数要在设
11、定点运行而且要确认它们始终在各自规定的范围内。 通常，操作范围窄的设备需要更精细的控制和监测程序。 在工艺的所有阶段都要评价柱层析的参数：平衡、上样、冲洗、洗脱、再生、清洗和保存,层析柱工艺验证,操作参数的控制 建立层析柱时，部分参数就确定了，比如柱高、柱体积和各类填料的柱效。 层析操作时通常还要监测其它的参数，包括流速、保留时间、操作压力、过柱的溶液体积、PH、电导、温度以及工艺时间。例如，采用在线检测来分段收集样品，决定哪部分样品要收集的标准通常是关键操作参数。 并非所有参数都与工艺直接相关，比如说最大操作压力通常受制于层析柱。,层析柱工艺验证,操作参数的控制 下游操作通常要使用各种溶液如
12、工艺缓冲液、病毒灭活溶液和层析柱再生/消毒溶液。溶液参数如PH和电导在制备和保存时可能会变化，但是在使用期间都应该保持在可接受范围内。 溶液必须按照批生产记录进行配制并有适当的过程控制。,层析柱工艺验证,操作参数的控制 提前配制浓缩液，再通过计量泵或比例调节阀来稀释，会使工艺更加复杂且需要额外的监测。 梯度洗脱工艺，在柱前或混合器后通常有额外的传感器来反馈控制，如UV，pH，电导率，或近红外光谱水平。 若工艺要求偏离室温操作，需要监测热交换器两端或中间体储罐的温度。,层析柱工艺验证,层析柱性能监测 一致性批次生产比日常生产需要更多的监测和取样。 层析柱性能通过分析输出参数来监测的（如色谱图，运
13、行记录，完整步骤的确认，收率），以此来保证产品质量和杂质水平在可接受的范围内,层析柱工艺验证,层析柱性能监测 层析用于各种分离，每个分离都应取样分析，证明该步的目的已达到。分析应能证明产品和杂质按照预期进行分离。这对于那些影响最终产品安全性、效价和效力的特定杂质特别重要。因此要证明这些杂质能始终如一地被去除。,层析柱工艺验证,层析柱性能监测 一般认为回顾色谱图是定性，要争取将峰形比较定量化。可以分析几个特征，如保留时间（或体积），峰面积（要在检测器的线性范围内），和峰对称性。穿透上样法测柱效是一个准确且灵敏的工具，用于监测层析柱性能和填料完整性。此外，色谱图出现的任何异常变化都要记录和调查，如
14、峰/谷/双肩的数量和形状。目的是发现和识别层析文件不符常规的地方。由于变化会受到诸如原料等的影响，因此在评价色谱图时要比较定性和定量限度。,层析柱工艺验证,杂质去除 一致性批次验证要证明杂质（如宿主细胞蛋白、DNA）去除到预期水平具有重现性。选择研究杂质要依据研发时定义的该步骤的目的，且要满足与生产规模一样的标准。,层析柱工艺验证,微生物负载和内毒素控制 验证期间，微生物负载和内毒素控制要通过测试每一柱的样品来证明。验证期间的微生物负载和内毒素控制反应层析工艺所用清洗液和保存液的效力，也反应商业设备的清洗和消毒效力。日常生产要设置控制限（或过程控制）。,层析柱工艺验证,小规模验证研究 小规模验
15、证研究包括不能采用生产规模的研究（如病毒去除验证）或不希望采用生产规模的研究（如填料寿命研究）。这些研究可以在生产规模研究的前、中、后进行。,层析柱工艺验证,病毒去除研究 病毒去除研究应证明层析步骤去除和灭活病毒的能力。由于生产设备不适合引入病毒，病毒去除研究采用能代表生产工艺的小规模模型。生产工艺的病毒去除研究，连同原料筛选和适当的产品测试，保证从产品传递到患者的病毒下降到安全水平。迄今为止，还没有来源于细胞系的生物技术产品牵扯到病毒传染中。,层析柱工艺验证,病毒去除研究 病毒去除验证从研发早期开始，到临床III期要求更为严格。 所有选定步骤都要经过适合病毒复制的培养皿测试。 研究要精心设计
16、，可以的话，要研究工艺的最差情况。如果能够证明特定步骤能够充分去除病毒，就不需要评价纯化工艺每个步骤的病毒去除。如果可以，要确定病毒在层析峰中的分布情况，这可增加工艺知识。,层析柱工艺验证,填料寿命研究 填料寿命研究证明填料在预期使用期限内，能够始终保持可接受的性能。该研究先采用小规模预估填料寿命，为大规模生产提供保证。此外在生产规模，要通过验证方案进行长期确认。另一种确认方法是将小规模研究柱子性能的可接受标准纳入日常工艺监控程序。,层析柱工艺验证,填料寿命研究 生产规模寿命研究通常采用统计过程控制和性能属性监测趋势，来核实已验证的操作参数，如最大使用次数和或最长使用期限。 随着重复使用和长期
17、储存，填料性能会发生改变。,层析柱工艺验证,填料寿命研究 影响填料寿命的因素有: 料液性质(杂质的数量和性质)， 所处的工艺阶段（捕获VS精纯）， 填料类型， 工艺条件（包括再生和清洗）， 储存条件 柱子的重装。,层析柱工艺验证,层析柱清洗和再生 层析填料专用于一个产品，然而，批与批之间的携带量应最小化。 多次使用导致填料老化的最重要因素之一是再生。 在进行验证研究设计时就应考虑介质的再生方法，以便建立介质重复使用限度。在工艺开发阶段，就应开发有效的介质清洁程序，以便介质可以重复使用并且提供充分的消毒。,层析柱工艺验证,层析柱清洗和再生 介质清洗程序的有效性通过缩小规模前验证研究建立，然后在生
18、产规模条件下，通过一个验证方案或者通过连续的监测进行确认。介质的清洁程序应有效，以阻止残留物的积累。这将最小化对后续批的残留，保持介质的性能。,层析柱工艺验证,有效的介质清洁和最小化携带量可按照如下程序进行空白/模拟洗脱来证明： 清洗和储存柱子 按往常一样准备柱子，然而不上样品或使用平衡液取代样品进行上样。 进行常规的后续步骤，包括洗脱步骤并收集代表常规样品洗脱体积的洗脱液。 进行产品残留和杂质残留量测试。,层析柱工艺验证,储存 介质储存溶液应能够控制微生物的生长，同时与介质和设备相容 储存溶液的有效性应通过抑制细菌和抑制真菌验证，同时评价对介质的潜在影响（例如配基脱落或介质基质降解）。 通常
19、用于生物负载和内毒素测试的样品取自保存后。 储存时间应进行确认。在平衡时，储存溶液的去除应进行证明。 在介质寿命验证过程中已装填或未装填介质的储存条件将进行验证。因为在小规模条件下进行前瞻性的、长期的储存研究是不切实际的。,层析柱工艺验证,工艺相关杂质 除了生产规模一致性批测试，层析柱寿命的小规模研究将用于证明介质能始终如一地去除相关杂质（如，宿主细胞蛋白）。这些数据在支持验证杂质的去除以取代进行放行测试的需求方面是有效的,层析柱工艺验证,工艺相关杂质 色谱介质也可能引入杂质到样品中（脱落物）。这对于那些拥有高分子量配基的介质来说是尤其重要的，例如蛋白A或MAbs连接的介质基质，它们将有进入后
20、续纯化步骤的风险，而在随后的超滤过程中不能除去，最终进入到蛋白制剂中。因此，对于这些类型的介质，在介质寿命研究过程中，配基的脱落也应进行调查。,层析柱工艺验证,工艺相关杂质 拥有小分子功能基团的介质（如离子交换介质）也可能脱落到样品中。通常，对于这些类型的介质，由于它们的稳定性（也就是很低水平的脱落）和与产品共纯化的低风险性（也就是它们将在随后的超滤和色谱纯化过程中除去），并不进行配基脱落检查。有关介质的脱落和溶出信息通常可在厂家提供的法规支持文件中找到。共纯化的可能性和潜在的后果，如果某种配基确实共纯化，应在验证测试中决定。,层析柱工艺验证,验证文件 验证文件要清楚地证明工艺按照设计进行安装
21、和运行，能够重复地产生预期结果。 主要的验证文件由经批准的包含可接受标准的方案和相关的最终报告组成。验证主计划，工艺特性报告，和其他的研究报告为这些文件提供基础保证。 方案和报告应当为生产工艺提供数据支持。 每个层析步骤可能有一个单独的方案和报告，或者一个完整的纯化工艺采用一个大的方案。,层析柱工艺验证,方案和报告 层析系统验证的方案和报告和其他工艺验证方案一样。开发方案要基于研发报告的数据。要清楚定义可接受标准和基本原理。一份正式的报告应该总结研究数据，确认关键和重要的操作参数并有验证结论。,层析柱工艺验证,方案和报告 验证方案要记录为什么验证以及怎么验证。 方案内容包括产品和工艺的描述，操
22、作参数，分析程序，和可接受标准。 重要参数超出可接受标准可能导致产品质量问题，应该进行调查。 超出操作范围要予以记录，在验证报告中作出解释并评价其对验证的影响。,层析柱工艺验证,方案和报告 方案必须经过起草人和相关人员的审核和批准，并经过质量部的最终批准。 报告要记录验证是怎么执行的，解释偏差并分析他们的影响，列出结果，提出验证结论。 例如，验证方案要描述试验方法，包括取样程序；验证报告要引用测试方法程序，包括版本号。,层析柱工艺验证,层析工艺经过验证且进入日常生产，后验证活动就开始了。 由于大部分的初始验证都是采用小规模执行的（如寿命研究，病毒去除），应该有一份文件化的计划来定期确认生产规模的性能。例如，生产规模填料寿命的终止可以通过测量收率、工艺相关杂质和产品相关杂质、或该步骤的任何其他功能。 应该执行持续工艺监测，来将工艺维持在已验证的参数内。,后验证活动,持续监测和维护 验证的理念是持续更新的。监管机构普遍认识到3个成功的一致性批次不能标明工艺控制状态。应该有监控和维护验证状态的系统。作为验证周期的一部分，生产批次的数据应该证明操作控制和产品质量具有一致性。,后验证活动,变更控制 要建立一个全面的变更控制程序来维持验证状态。 改变性验证的原因可能包括： 工艺改进 应用新技术和工艺控制方法（如PAT） 场所变更 设备变更 原材料变更 规模变更,后验证活动,谢 谢 ！,
