1、比较 TALEN 技术与 ZFN 技术重组锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）技术与转录激活因子样效应蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技术是可以对基因组进行定点修饰的基因编辑技术，可精确地定位到基因组的某一位点上并剪断靶标 DNA 片段从而插入新的基因片段，从而对原基因组进行“编辑” 。ZFN 技术依赖于特异性识别并结合 DNA 的锌指蛋白和 FokI 核酸内切酶可剪切结构域组成的融合蛋白，可切割特异 DNA 序列并引起 DNA 双链断裂（double-strand breaks
2、，DSB） ，DSB 激活细胞的 DNA 修复机制，从而定点修饰基因组。TALEN 是由转录激活因子样效应物（TALE）代替 ZF 与 FokI 核酸内切割域组成的基因编辑工具。一、结构与原理ZFN 技术中，锌指结构域通常由 3-6Cys2-His2 型锌指单元串联而成，他们借助一个 Zn2+形成 构象，其中 螺旋中的 -1，+3 ，+6 位的三个氨基酸直接与靶 DNA 的三联碱基相互作用。这三个残基中的任一残基的改变都会影响 ZF 对目标碱基的识别。根据目的基因设计 8-10 个锌指结构域并与 FokI 结合可构成靶向特定位点的 ZFNs，在 FokI 切割域的二聚化作用下完成对目的基因的编
3、辑。TALE 蛋白包括三部分：N 端序列、C 端序列、由高度保守的重复单元组成的中心重复区。每个重复单元中除 12、13 位氨基酸可变外其余几乎相同，12、13 位的两个氨基酸被称为重复可变的双氨基酸残基（repeat varible di-residues，RVDs ） 。RVD 与 A、T、C、G 之间有着严格的对应关系，即 NI-A；NG-T； HD-C；NN-G。构建 TALE 时，根据靶 DNA 序列变换 RVDs 并串联重复单元并与 FokI 切割结构域结合，TALE 与靶位点结合，二聚化的 FokI 对其进行切割，完成基因编辑操作。二、ZFN、TALEN 异同点比较与 ZFN 相
4、比，TALEN 的优势是十分明显的。第一，TALEN 简化了 ZFN复杂的筛选过程，在简单的分子克隆条件下就可构建出高效的 TALEN；第二，TALEN 结合 DNA 序列更为严格，打靶效率高于 ZFN；第三，TALEN 降低了脱靶的可能性，从而降低了对受体细胞的毒性。详细比较如下：2.1 共同点1. 二者均为人工改造的核酸内切酶，由特异性识别靶 DNA 的识别域和非特异性剪切 dsDNA 的切割域，他们配合着行使功能，缺一不可。2. ZFN、TALEN 中的 FokI 是源于黄单胞杆菌的一种限制性核酸内切酶，它只有形成二聚体时才对 dsDNA 具有剪切活性。3. FokI 切割 DNA 后的
5、修复机制相同：在两个靶位点之间剪切 DNA，在 DSB处诱发 DNA 的同源重组修复机制和非同源末端连接修复机制，从而达到定点修饰。2.2 不同点1. 开发时间：最早的 ZFN 出现在 18 年前，而 TALEN 技术才于 2007 年问世。2. 靶 DNA 序列的识别：ZF 结构域识别的是三联碱基，而 TALEN 结构域识别的是某特定的核苷酸。例如：某蛋白包括两个锌指结构域，可识别六个碱基；而当它包括两个 TALEN 结构域时即两个 RVD，仅能识别两个碱基。此外，TALEN 的 RVD 与碱基之间的对应关系与物种、细胞、DNA 序列无关，并且设计简单，成本低，与 ZFN 相比活性更高。3.
6、 上下文依赖效应：ZFN 在识别 DNA 序列时，重复氨基酸之间会产生相互作用，也就是上下文依赖效应，从而使得识别的特异性发生了改变，影响基因修饰效率。还未见 TALEN 上下文依赖效应的相关报道。4. 对细胞的毒性效应：锌指酶切割 DNA 时易产生脱靶现象，对细胞产生了毒副作用。TALEN 脱靶情况较少，毒性小。例如：通过点对点地比较二者对人细胞内源基因 CCR5 的删除效果，发现在效率大体相同的情况下，目前实验数据显示 TALE 所产生的细胞毒性比 ZFN 小得多。5. 靶向基因序列长度：与 ZFN 相比，TALEN 可以识别更长的靶基因序列。三、存在的问题与展望目前，ZFN 技术还存在以
7、下困惑：锌指蛋白结构域与 DNA 结合的特异性、亲和性有待提高；如何让解决 ZFN 的高效导入、可调控切、瞬时表达问题；ZFN 对细胞的潜在综合作用需进行综合评价，并对引起的潜在免疫反应，尤其是针对于源于细菌的 FokI 结构域的客观评价。同样地，TALEN 技术还存在以下问题：设计识别 20 个碱基含有 1000 多个氨基酸的 TALEN 蛋白，会引起机体的免疫应答，降低了其在细胞中的打靶效率；TALEN 同样会产生脱靶的现象，可能由于细胞中染色体的状态引起，如TALEN 技术对于异染色质化的基因无效； TALEN 技术的应用主要集中在基因敲除方面，但是否适合大片段基因的插入尚不明确。ZFN、TALEN 技术为人们定向改造基因提供了基础，但相关应用还处于初级阶段，但他们在转基因动、植物的研究方面尤其是 TALEN 技术在基因治疗上仍然显示出了巨大的应用价值。2012 年 Science 在评述中把 TALEN 称为基因组的“巡航导弹” ，还大胆预测 TALEN 技术将成为所有分子生物学实验室都要掌握的基本实验技能。
