1、RNA干扰技术及其应用,生工1002 李奔存,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006,安德鲁法尔 AndrewZ.Fire 美国 美国麻省理工学院 1959,雷格梅洛 Craig C.Mello 美国 哈佛大学 1960,For there discovery of RNA interference-gene silencing by double-stranded RNA,RNAi（RNA interference，RNA干扰）,Double-stranded RNA inhibits expression of genes homolo
2、gous to that RNA.双链RNA抑制含其同源序列基因的表达,Brief History of RNAi Discoveries,1990年，RichJorgensen 设想，在矮牵牛中花插入一种催生红色素的基因，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，花的颜色变为白色，当时称共抑制（cosuppression),95年Guo和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA 同样的结果特异性阻断该基因的表达，从而正式表明
3、RNA 干扰现象的存在。,94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制 (quelling)。,1998年Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNAinterference的概念,A control: not stained B: wt C: wt + antisense RNA D: wt + ds RNA,2001年Elbashir等 Nature上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功的在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。,三.RNAi作用机制,起始阶段,效应阶段,扩增扩散阶段,起始阶段,
4、病毒基因、人工转入基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA 这些dsRNA被胞质中的RNase特异核酸酶Dicer切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp），即siRNA siRNA的特点：3端均有23个突出的核苷酸,siRNA双链结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex, or RISC）,效应阶段,在ATP存在情况下，siRNA双链展开激活RISC，激活的RISC即可通过碱基互补与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合
5、部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应,siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA。 依次循环：新合成的长链dsRNA同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成一切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。,扩增扩散阶段,四、RNAi研究的一般技术路线,确定目的基因,设计siRNA的序列,获得siRNA产物,si
6、RNA转染,RNAi效果检测,化学合成,体外转录,长片段RNA消化,siRNA表达载体,siRNA表达框架,1.siRNA的一般结构： 哺乳动物：21-23bp dsRNA其它生物：更长的片段,四 siRNA的设计,2.设计流程（选择siRNA靶位点） 从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点；根据5和3非翻译区（UTR)及靠近起始密码子（75个碱基之内）等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。 将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它编码序列同源的靶序列。 设计阴性对照：阴性对照siRNA应与siRNA的
7、核苷酸组成相同但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸顺序并经同源序列比较确证而得。,获得siRNA产物,1、化学合成 尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。 由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究； 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素,2、
8、体外转录,DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs,相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。 更重要的是能够更快的得到siRNAs。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。 不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。,3.用RNase III 消化长片断双链RN
9、A制备siRNA,其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。 这个方法是选择通常是2001000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。 在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。,dsRNA消化法的主要优点
10、在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III比用Dicer要便宜）。 不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗,3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA,4.siRNA表达载体,毫无疑问，siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 开
11、始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。,由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。 不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。,4.siRNA表达载体,最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）,5. siRNA表达框架,siRNA表达框架(
12、siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。 和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。 因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配！,如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，
13、可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。 构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。 这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。 最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子； 不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了） 。,5. siRNA表达框架,五、RNA干扰的应用,1、研究基因功能的新工具线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。 2、开展基因治疗的新策略 RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。 3、进行药物筛选的工具,RNA干扰仍存在的问题,目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍； 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚；目前RNAi 机制尚未完全阐明。,
