1、高效液相色谱法在食品分析中的应用摘要：随着科学技术的不断发展，食品检测方法被不断开发出来，高效液相色谱法（HPLC）作为色谱分析法的一个分支，是一种热门的新型分离分析技术。本文将从高效液相色谱的原理及特点进行综述，将会着重介绍高效液相色谱在食品样品分析中的应用及操作方法，并对高效液相色谱法的应用前景进行了展望。关键词：高效液相色谱，食品分析，应用Application of High Performance Liquid Chromatography in food analysisAbstract: With the continuous development of science and
2、 technology, food detection methods have been developed, high performance liquid chromatography (HPLC) as a branch of chromatographic analysis, is a popular new separation and analysis technology. In this paper, the principle and characteristics of high performance liquid chromatography (HPLC) was s
3、ummarized. The application and operation method of high performance liquid chromatography (HPLC) in food sample analysis was introduced. The application prospect of high performance liquid chromatography (HPLC) was also discussed.Key woeds:high performance liquid chromatography (HPLC) ;food analysis
4、;application1 高效液相色谱概述1.1 背景1903n 年俄国植物化学家 Tswett 首次提出“色谱法”（Chromatography）和“色谱图”（Chromatogram）的概念。1930 年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。1952 年，英国学者 Martin 和 Synge基于他们在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气-液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技术向前推进了一大步，这是气相色谱在此后的十多年间发展迅速的原因。1960 年中后期，气相色谱理论和实践发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，将高压泵和化学键和固定相用于液相色谱就出现
5、了高效液相色谱。1970 年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。1.2 原理高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography ,HPLC）是 20世纪 70 年代发展起来的一种以液体为流动相的分离分析技术。其基本原理是各组分在固定相和流动相中的吸附能力存在差异，当溶于流动相中的各组分流经固定相时，各组分在两相之间进行反复多次吸附与分配，由于各组分在两相间的分配系数不同，各组分就会先后流出色谱柱，结合柱后检测器加以检测，从而实现各组分被分离检测的目的。1高效液相色谱仪主要由输液泵、色谱柱、检测器、记录器等组成。它将
6、具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等作为流动相，用输液泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱，注入样品溶液，经流动相带入柱内，在填充剂上分离后，各成分先后进入检测器，记录色谱图，进行定性定量分析2。压力表溶剂槽高压 输液泵梯度淋洗进样器参比色谱柱样品色谱柱紫光监测器氢焰监测器视差折光监测器记录仪图 1 高效液相色谱仪结构示意图高效液相色谱中包括多种分离模式。按色谱过程的分离机制，可以将液相色谱法分为吸附色谱、分配色谱、空间排阻色谱、离子交换色谱及亲和色谱等类别。根据流动相与固定相极性的差别，也可分为正相色谱和反相色谱两种模式。流动相的极性大于固定相的极性时，称为反相色谱；反之，称为正
7、相色谱。31.3 特点高效液相色谱法（HPLC）作为色谱分析法的一个分支，是一种新型的分离分析技术，它是在经典液相色谱的基础上引入气相色谱的理论，在技术上采用高效微粒固定相、新型高压输液泵和高灵敏度检测器，从而具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高的特点。其综合了气相色谱和经典液相色谱的优点，并加以发展，尤其对高沸点仍不气化的热不稳定生理活性物质具有良好的分析效果，其分析速度快、操作简单、灵敏度好、分离效能高，分离和测定一次完成，可以和多种波谱分析仪器联用，易于自动化，现在的色谱仪器已经可以实现从进样到数据处理的全自动化操作。因此多被应用于食品分析、生物化学、环境分析、药物及临床分析等4。色谱法
8、最大的缺点便是定性能力较差。为克服这一缺点，已经发展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用。尤其是气质联用技术的快速发展，大大克服了色谱法的缺点。随着色谱技术的发展，结合计算机各种软件的开发，使 HPLC 与各种检测仪器联用，更加拓宽了HPLC 的应用范围。近年来，高效液相色谱仪的各个组成部件都有新的发展，使HPLC 分析更加灵敏准确、简便快速。特别是联用技术的发展，使之在药物分析、环境监测及生命科学领域的应用更具重要意义2。目前我国已逐渐将 HPLC 法列为食品检测添加剂、污染物、无机成分、营养成分、毒素等的国标方法5。高效液相色谱法适于分析分子量大、受热不稳定易分解的、高沸点不
9、易挥发的、自动收集器不同极性的有机化合物；多种天然产物和生物活性物质；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及食品、环境污染物、合成药物、生物化工产品及石油产品等，约占全部有机化合物的 80%。32 高效液相色谱仪的使用方法以日本岛津 LC-20AT 高效液相色谱仪为例，其包括 CBM-20A 系统控制器、LC-20AT 溶液传输单元、DGU-20A3 真空脱气机、SPD-M20A 二极管阵列检测器、SIL-20A 自动进样器、RF-10AXL 荧光检测器以及 CTO-20A 柱温箱和 Varian380-LC蒸发光检测器等部分。本仪器采用高压梯度通过高压输液泵分别独立精确控制流量、调整溶剂浓度
10、比例，实现高效率、高精度混合；即配备了可提供全波长三维信息的二极管阵列检测器，全新的光路设计与有效的梯形狭缝池设计保证了高分辨率和高灵敏度；也配备了灵敏度更高、选择性更好的荧光检测器；还配备了具有高灵敏度、检测范围更广的蒸发光检测器。本仪器可以高效地分离分析高沸点、热不稳定的有机及生化试样；二极管阵列检测器对大部分有机化合物有响应；荧光检测器可以检测产生荧光的物质，对如多环芳烃、维生素 B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；蒸发光散射检测器对碳氢化合物、表面活性剂、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油和挥发性低于流动相的任何样品、不含发色团的化合物有响应。实验操作开始前应先
11、确定好色谱条件，例如流动相的成分及比例，检测波长和柱温等等，其次是制备好对照品和供试品溶液。接下来就可以将样品进行检测了，高效液相色谱仪操作步骤： 1) 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2) 对抽滤后的流动相进行超声脱气 10-20 分钟。 3) 打开 HPLC 工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4) 进入 HPLC 控制界面主菜单，点击 manual，进入手动菜单。 5) 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在 manual 菜单下，先点击 purge，再点击 start，冲洗
12、时速度不要超过 10 ml/min。6) 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过 2000。点击 injure，选用合适的流速，点击 on，走基线，观察基线的情况。7) 设计走样方法。点击 file，选取 select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击 new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击 protocol。一个完整的走样方法需要包括：a. 进样前的稳流，一般 2-5 分钟；b. 基线归零；c.进样阀的 loading-inject 转换；
13、d.走样时间，随不同的样品而不同。 8) 进样和进样后操作。选定走样方法，点击 start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击 postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。9). 积分 单击再解析，打开已经完成的数据，会看到数据、方法、报告格式、批处理、全部文件形式。 点击分析图标，选择多色谱，提取所要波长下的峰。 在积分页面，选择通道，半峰宽，斜率，最小峰面积，一般选择面积选项。识别页面，利用时间窗或时间带限制峰。3 高效液相色谱法在食品分析中的应用高效液相色谱法在食品分析中有着广泛的应用，如分析食品中的营养成分、食品添加剂、有害物质残
14、留等等3.1 分析食品中的营养成分对食品中营养成分进行检测具有两方面的意义：一方面为了避免人体中维生素、氨基酸等营养成分的缺乏，就要有目的的从不同食物中获取营养成分，从而合理安排膳食。因此可以利用高效液相色谱法获知食品中所含的成分种类及含量。另一方面可以通过食品中相关成分的检测为合理的开发利用天然食品提供依据。贺利民6等使用美国 TSP 公司的 Spectra SYSTEM UV3000HR 可高速扫描的紫外可见检测器，实现了维生素 A、D 和 E 的同时紫外区扫描，据此选择各自最大吸收性波长，探讨了南中国深海小鱼中脂溶性维生素 A、D 和 E 的 3波长同时测定，质量浓度为 0.1010mg
15、/L 范围内，维生素 A、D、E 均呈现良好的线性关系，检出限为 0.050.62mg/L，回收率在 90.0%110%之间，方法准确度和精密度完全符合分析检测要求。李艳艳3等采用日本岛津 LC-20A 高效液相色谱仪对豆奶粉中的四种大豆异黄酮（大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素）进行了测定。大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的线性范围分别是0.74100.00g/mL，0.74200.00g/mL，0.167500.00g/mL，0.198160.00g/mL（r0.9996），线性关系良好；加样回收率（n=9）分别为100.01%，100.01%，99.48%，99.91%，方法简便、
16、灵敏、准确，适用于豆奶粉中这四种大豆异黄酮成分的含量测定和产品质量控制。3.2 分析食品中的添加剂近年来，食品安全问题频频曝光，食品生产过程中添加剂的过量使用及非法添加物的使用是导致食品安全问题贫乏的重要因素之一。目前食品添加剂存在的安全风险主要包括两个方面：一是法定允许使用的食品添加剂过量、超范围使用，二是不法生产者将一些工业用的化学品或未达到食品添加剂标准的原料非法添加到食品中。这些不法添加剂的使用可能会危害身体健康，因此必须加强对食品添加剂的检测。刘敏等7采用简单高效的前处理技术，并结合高效液相色谱法对多种食品添加剂及违法添加物进行了定性和定量研究。以调味品、饼干、加工肉制品三类具有一定
17、代表性的基质复杂的样品作为检测对象，以 8种抗氧化剂为目标分析产物，用凝胶渗透色谱（GPC）净化经 C18 柱高效液相色谱分析，三种样品的添加回收率均在 75.62%104.19%之间，相对标准偏差小于 10%，检出限为 0.311.46g/g。3.3 分析有害物质残留在一些食品中会有农药兽药以及霉菌毒素等有害物质残留，危害人体健康。因此对对食品中这些物质进行检测是十分必要的。应用高效液相色谱技术和免疫亲和柱萃取，检测限为 10ng/kg，可检测酸奶等食品中是否含有黄曲霉素；应用高效液相色谱与大气压化学电离质谱联用，检测限为 0.12pg/kg，可检测粗提物食品中的玉米烯酮霉素。8目前检测食品
18、中的兽药残留主要用 ODS-C18 色谱柱的方法，检测呋喃唑酮的残留量使用的流动相中乙腈、水和磷酸的体积比为 40:6:1.动物性肌肉中的金霉素、四环素、土霉素和强力霉素等残留也可通过固相萃取-高效液相色谱技术进行检测，液相检测技术检测兽药残留的准确度高，回收率达到 85%以上。4 结语综上所述，高效液相色谱法作为目前市场上进行食品安全检测的一种高效方便、准确实用的分析分离手段，得到了广泛应用。通过液相色谱检测技术可以进行多种食品营养成分分析和食品添加剂及有害物质检测等问题，提升食品质量。随着科学技术的不断进步，食品检测技术也会越来越多样，越来越便捷准确，高效液相色谱法在食品中的应用也将会越来
19、越广泛。参考文献：1高效液相色谱法-离子色谱法在环境分析和食品分析中的应用研究，熊建飞2高效液相色谱法在食品分析和药物分析中的应用研究，辛丹敏3高效液相色谱法测定杜仲中主要成分和食品中大豆异黄酮，李艳艳4 谢云峰，王浩，刘佟等.在线固相萃取-高效液相色谱联用测定动物源食品中的维生素 A、EJ.分析化学，2014,11（9 ）：1343-1347.5 高效液相色谱在食品分析中的应用分析，刘子奇6贺利民，吕岱竹，吴莉宇.高效液相色谱法同时测定无骨海鱼中的维生素 A、D 和 EJ.分析试验室.2004,23 （5）：77-797 高效液相色谱在食品质量检测中的应用，刘先德8张秀尧，蔡欣欣，李毅等.超高液相色谱串联质谱法检测食品中蜡样芽巴杆菌呕吐毒素 CereulideJ.分析化学，2012,40(8):1267-1273.
