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类型细胞爬片步骤.doc

  • 上传人:精品资料
  • 文档编号:10886997
  • 上传时间:2020-01-17
  • 格式:DOC
  • 页数:2
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    1、细胞爬片步骤PLL 配制和处理(Sigma 产品,武汉博士德分装,10ml/瓶。 4存放,有效期 1 年)(1) 储存液:1:10 稀释液可以保存在 4里,三个月内仍然可以使用。稀释、储存和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。工作液:0.1%( w/v)PLL,用移液枪吸取 0.3ml PLL3ml 无菌去离子水,混匀放于10ml 无菌塑料离心管中。封口模密封后 4存放。(2) 无菌处理:PLL 不可以高温消毒,故应过滤除菌分装于无菌处理的细胞冻存管内,1ml/管,封口模密封,4保存。另外,准备无菌去离子水 50ml。多聚赖氨酸 PLL 包被(1)灭菌的去离子水(三蒸水 )1:10 稀释多聚赖氨酸溶

    2、液。(2)用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内,使其温度维持在 18-26。(3)将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液 5 分钟。 (注意增加时间不会提高包被效果) 。(4)将过滤除菌的多聚赖氨酸加入一个消毒好的培养皿(超净台内操作) ,然后将高压灭菌的小玻片放到多聚赖氨酸内浸泡 5min,无菌晾干即可。 (底面贴紧培养皿,存在包被PLL 不好的可能,放入培养板孔内注意正反面!) 或者: 铺片于培养皿中,移液枪将PLL 工作液滴加于玻片上,室温 10 分钟后,用消毒好的纱布条吸取玻片上的 PLL 液。在超静台内风干后使用,或者超静台内过夜晾干,次日使用。或者:在 60烘箱 1 小时干燥,或室温 18

    3、-26过夜干燥待用。步骤:(1)准备 24 孔细胞培养板(消毒好的培养皿)(2)多聚赖氨酸 PLL 包被(3)培养板每孔中滴 1 滴培养基,然后将玻片置于液滴上,压紧(通过表面张力的作用将玻片吸附于培养板上)(4)常规细胞消化,离心,重悬,将吹打的细胞悬液分别加到每个孔盖玻片上,让其贴壁生长, 可以用移液枪加样 30l 于盖玻片上(5)24 孔板做完细胞爬片后,再小心用镊子将爬片取出,细胞面朝向载玻片,用中性树胶封片,照相。 (主张用 20%-50%甘油封片,中性树胶封的不好容易“花片” )(6)PBS 洗涤,以去除血清等物质。 (接着做 IC)细胞爬片方法与技巧爬片的准备:1、爬片可用一般的

    4、盖玻片,也可用专用爬片;2、应用盖玻片,可根据自己的需要剪裁成合适的大小,以备置于 6 孔板、12 孔板或24 孔板;3、将剪裁好的爬片,置于浓硫酸中浸泡并过夜,第二天先用自来水冲洗 20 遍,再用三蒸水冲洗 3 遍(个人认为主要目的是冲洗干净就可以了) ,放在饭盒或者培养皿(一定是玻璃的哦,要不然就)中烘干后进行高压消毒。培养板的准备:1、 泡酸过夜2、 冲洗,烘干(1、2 步骤与前大致相同)3、 放入超净工作台用紫外线照 12 小时就可以用了(在照之前可以将爬片一并放入,若细胞贴壁能力不强,可经多聚赖氨酸浸片后放入。贴壁能力强的话,就可以省略了,进行紫外线消毒)注: 此步自己的经验是爬片可以先浸入消毒后的 PBS 内,紧接着放入培养板内。目的:浸过 PBS 的爬片依靠表面的液体,可以用培养板孔底贴和紧密,以利于细胞长到爬片上。 (自己刚开始做的时候,经常就是细胞全都长在了爬片与培养板之间,爬片上细胞罕见。)细胞爬片:1、 胰酶消化细胞后计数2、 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可3、 第二天即可进行干预措施

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