1、 番茄抗黄曲叶病基因 Ty-2 精密定位及异同抗性基因效用比对第一章引 言番茄(Solanum lycopersicum)是一种世界性经济作物，我国的番茄栽培面积和总产量均居世界首位。据 FAO (联合国粮农组织) 统计，2009 年我国番茄栽培面积为 1504803 hm2，产量达到 34120040 t。番茄生产中经常受到病毒病的危害，由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)引起的番茄黄化曲叶病特别严重。该病害在番茄幼苗、开花、结果、采收的各个时期均可发生，一旦发生，扩散迅速，造成番茄品质和产量严重下降，植株早期感病会导致绝收(Jones
2、,2009)。该病于 20 世纪 50 年代末始发于以色列，目前已在全世界 40 多个国家和地区大面积暴发(Boulton et al., 2003; Varma Malathi, 2003)，自 20 世纪 90 年代传入我国以来，由南向北、自东向西迅速全国性蔓延，已在台湾、广东、广西、浙江、江苏、上海、云南、四川、陕西、山东、安徽、河北、天津和北京等 20 多个番茄主产区大范围发生，特别是对我国北方秋茬保护地和南方露地番茄生产造成了极其严重的损失。据各地植保部门的不完全统计，目前我国番茄黄化曲叶病毒病的年发生面积超过 6.7 万 hm2，经济损失超过 20 亿元。番茄黄化曲叶病毒在自然条件
3、下由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播，生产中可以利用 60 目的网纱进行物理隔离、喷施化学或生物药剂、利用烟粉虱的生物天敌以及加强田间管理来防治烟粉虱对 TYLCV 的传播，但是由于投资成本较高、化学药剂污染环境、害虫抗药性、病毒快速变异等因素不能从根本上达到控制 TYLCV 的目的。因此，利用抗病基因选育适合当地的抗病品种是抗 TYLCV 最根本有效的解决方法(Abdelbacki et al., 2010)。研究表明，栽培番茄资源中缺乏对 TYLCV 的抗性种质，仅有一些种质表现为耐病，高抗 TYLCV 的材料都存在于近缘野生种中。目前已报道的抗 TYLCV 的野生番茄主要有多毛
4、番茄(S.habrochaites) 、醋栗番茄 (S. pimpinellfium)、秘鲁番茄(S. peruvianum)、智利番茄(S. chiense)和契斯曼尼番茄(S. cheesmanii)，利用这些野生材料定位到 5 个抗 TYLCV 的基因：Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4 和 Ty-5 (Anbinder et al., 2009; Hanson et al., 2000, 2006; Ji et al., 2007b; Ji et al., 2009b; Pico et al.,1996; Scott, 2007; Vidavski, 2007; Zamir et
5、al., 1994)。国内外研究学者已利用分子标记辅助选择方法，选育出了一些抗 TYLCV 的品种并推广到生产中。但是大多数品种含有的抗性基因片段比较长，还存在一些不良性状的连锁累赘，而且利用现有的分子标记在筛选抗性材料的过程中，会产生假阳性，也容易丢失掉一些本来抗病的材料。因此，对已定位的抗性基因进一步精细定位，获得共分离的分子标记，可提高分子标记辅助选择效率，同时对于克隆目的基因和分析抗 TYLCV 分子机制均具有重要意义。在病害大规模爆发时，含有单个基因的番茄品种的抗性容易降低。因此，多基因聚合育种成为一种趋势， Vidavski 等（2008）证明通过聚合不同抗源的基因可以提高番茄对
6、TYLCV 的抗性，但是相关方面的研究还比较少。不同抗性基因的遗传机理和来源背景不同，对不同基因的抗性水平进行研究，可以为研究不同抗性基因的互作机制和高抗 TYLCV 聚合育种提供理论基础。1.1 双生病毒1.1.1 形态学结构双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链环状 DNA 病毒，病毒粒子大小约 1830 nm，无包膜，电镜下观察病毒的壳体呈两个不完整的二十面体，蛋白亚基形成五聚体壳粒共 22 个分布在每个二十面体的面上，蛋白亚基的分子量约为 28 kD（图 1.1）。1.1.2 双生病毒分类双生病毒基因组包括单组份基因组和双组份基因组，每个组分基因组 DNA 大小为 2.53.0 kb
7、。双生病毒一般发生在热带和亚热带地区，通过昆虫以持久性循环型方式传播，经卵不传播。带毒昆虫介体通过刺吸寄主植物的韧皮部传染病毒（Goodman, 1977; Harrison et al., 1977）。自从 1977 年被正式命名以来，双生病毒科被划分为玉米线条病毒属(Mastrevirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus) 、番茄伪曲顶病毒属 (Topocuvirus) 和菜豆金色花叶病毒属 (Begomovirus) 四个属(Fauquetet al., 2003; Pringle,1999)，每个属在基因组结构、传播介体和寄主范围上存在差异。Mastrevirus、Curtov
8、irus 、Topocuvirus 均属于单组份双生病毒。Mastrevirus 属中有 17 个病毒，通过叶蝉（Eutettix tenellus）传播，主要侵染单子叶植物，特别是玉米、大豆、小麦等。Curtovirus 中有 6 个病毒，通过叶蝉或者角蝉 (Micrutalis malleifera)传播，只侵染双子叶植物，特别是甜菜、番茄和甜瓜。Topocuvirus 属中只含有番茄伪曲顶病毒(Tomato pseudo-curly top virus, TPCTV)，通过角蝉传播。Begomovirus 属病毒既有单组份又有双组份，是双生病毒科中种类最多、分布最广、危害最严重的一个属，
9、侵染双子叶植物，通过烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadiua)传播。第二章番茄抗黄化曲叶病基因 Ty-2 染色体片段内高分辨率遗传图谱构建目的基因所在染色体片段内高分辨率遗传图谱的构建是基因精细定位、克隆的关键，多态性分子标记则是构建高分辨率连锁图谱的基础。由于番茄的遗传基础狭窄，亲本间的多态性标记少，获得与目的基因紧密连锁的分子标记比较困难（Saliba-Colombani et al., 2000）。近年来随着番茄基因组序列的公布，基于 PCR 扩增的分子标记研究发展迅速。本研究拟以已公布的番茄基因组序列开发标记，构建目标染色体片段的高分辨率的分子遗传图谱，为 Ty-2 基
10、因的精细定位提供依据。2.1 材料与方法2.1.1 试验材料筛选标记所用的材料：抗病杂合体(Ty-2/ty-2)、抗病纯合体(Ty-2/Ty-2)和感病纯合体(ty-2/ty-2) 分别为 TyQueen、E951-7 和 Horizon。TyQueen 是一个商业杂交种。E951-7 是一个近等基因系(NILs)材料，仅在 11 号染色体含有 Ty-2 基因的抗性片段。Horizon 是一个普通栽培番茄。由美国佛罗里达大学海湾沿岸研究与教育中心 John W. Scott 教授提供。用于构建遗传图谱的材料是来源于 H24 的杂交种 H9205 的 F2 代群体，共 248 株，由中国农业科学
11、院蔬菜花卉研究所加工番茄课题组提供。第三章 番茄抗黄化曲叶病基因 Ty-2. 40-543.1 材料与方法. 40-413.1.1 试验材料 .403.1.2 DNA 提取. 403.1.3 标记来源和反应条件. 40-413.1.4 抗性鉴定和病情统计. 413.2 结果与分析 .41-523.3 讨论 .52-54第四章 Ty-2 候选基因分析 . 54-584.1 材料与方法. 544.1.1 基因组序列数据. 544.1.2 基因预测及注释. 544.2 结果与分析. 54-564.3 讨论. 56-58第五章 不同基因的抗性效应. 58-625.1 材料与方法 .58-595.1.1
12、 试验材料. 58-595.1.2 表型鉴定 .595.2 结果与分析 .59-605.3 讨论. 60-62结论1. 通过番茄基因组序列设计引物，使得第 11 号染色体上 Ty-2 基因附近 C2_At2g28250 和 T0302 之间区域内多态性标记增加到 56 个，包括 16 个 SCAR 标记和 40 个 CAPS 标记；16 个 SCAR 标记包括 6 个共显性 SCAR 标记和 16 个显性 SCAR 标记；40 个 CAPS 标记包括 34 个共显性 CAPS 标记和 6 个显性 CAPS 标记。这些标记均匀覆盖了番茄第 11 号染色体上长 500 kb 的染色体片段，两个标记
13、之间的平均距离 6000 bp。这些标记有助于开发基于单个碱基差异的 SNP 标记，加快分子标记抗病辅助选择育种。2. 构建了 Ty-2 基因目的区域染色体片段内高分辨率遗传图谱，将 Ty-2 基因定位到分子标记 UP8 和 M1 之间，遗传距离 0.4 cM，物理距离 300 kb，位于番茄基因组单个 scaffold (SL2.4sc03876)上。3. 在 11000 个 F4 单株中，筛选出在分子标记 C2_At1g07960 和 T0302 之间发生重组的单株 157 个，在 C2_At1g07960 和 M1 之间发生重组的单株 27 个。这些材料可以直接应用到育种中。4. 得到了
14、含有 Ty-2 基因最短抗性片段的近等基因系材料，该材料可以用于 BAC 文库的构建或者目的基因抗性片段重测序工作。5. 在 11000 个单株中没有发现在分子标记 C2At1g07960 和 C2At3g52090 之间发生重组的单株，这两个标记之间约 87 kb 范围内可能存在严重的重组抑制。6 获得了一个与 Ty-2 基因更加紧密连锁的共显性 SCAR 标记 P1-16，并对课题组的一些转育材料进行了验证，该标记比原来的 T0302 更准确，不会丢失到含有较短抗性片段的材料。7. 利用番茄基因组计划提供的信息，用生物信息学软件在 Ty-2 基因定位区域 300 kb 内预测到 35 个基
15、因，将位于重组位点、含有NB-ARC 类保守结构域的基因Solyc11g069620.1、Solyc11g069660.1、Solyc11g069920.1 、Solyc11g069670.1 和 Solyc11g069930.1 作为 Ty-2 的候选基因。8. 本研究中，只含有 Ty-2、Ty-3、Ty-4 基因的植株分别表现为抗病、中抗和感病；同时含有 Ty-2 和 Ty-3 或者 Ty-2 和 Ty-4 基因的植株均表现抗病；同时含有 Ty-3 和 Ty-4 基因的植株表现中抗；不同基因之间的抗性表现出累加效应，含有这 3 个基因的材料抗病效果最好。9. 得到了含有 Ty-2、Ty-3 和 Ty-4 不同抗性基因的近等基因系材料，可以直接用于育种中培育高抗 TYLCV 的品种。
