1、环介导等温扩增 （ LAMP） 引物设计 LAMP 引物设计关键点 ： Tm 值 ， 引物末端稳定性 ， GC 含量 ， 二级结构 ，引物间距 1.Tm 值 引物 Tm 值采用 Nearest-Neighbor Method 进行预测 ， 该法所预测的值可能是最为接近真实情况 。 通常情况下 ， Tm 值会受实验条件所影响 ， 例如盐浓度 、 寡核苷酸浓度 等 ， 因此需在实验条件下对 Tm 值进行预测 。 寡核苷酸 0.1 M； Na+ 50 mM； Mg2+ 4 mM； 各个引物的最终 Tm 值需尽量满足以下条件： F1c/B1c = 64-66 C； F2/B2、 F3、 B3 = 59
2、-61 C； LoopF/LoopB = 64-66 C； 2.引物末端稳定性 引物的末端是 DNA 复制的起点 ， 因此需要一定的稳定性 。 （ 通常情况下，引物需要一个稳定的 5 端和一个 相对 不稳定的 3 端，自由能 绝对值越高，则形成的 DNA 双链越稳定，即越容易退火。 ) F2/B2， F3/B3， LoopF/LoopB 的 3 末端自由能 -4 kcal/mol； F1c/B1c 的 5 末端自由能 -4 kcal/mol； 此处的末端自由能指末端 6 个碱基的自由能。 3.GC 含量 引物的 GC 含量尽量在 40-65%。 50-60%的 GC 含量可能会有更好效果。 4
3、.二级结构 需确保引物不会形成二级结构 ， 例如二聚体 ， 发卡 结构。 5.引物间距 F2 的 5 末端到 B2 的 5 末端约为 120-160 bp； F2 的 5 末端到 F1c 的 5 末端约为 40-60 bp； F3 的 3 末端到 F2 的 5 末端约为 0-60 bp； 1.上传序列 打开 PrimerExplorer V4 网站 ： http:/primerexplorer.jp/elamp4.0. 0/index.html 上传所选的 DNA 特异序列 （ 序列长度需小于 2000 bp） ， 参数选择Automatic Judgment， 然后点击 Primer Des
4、ign。 系统 自动 对 所上传 的 序列 进行分析 ： GC% 45%， 则判定为 AT Rich； 45% GC% 60%， 则判定为正常 ； GC% 60， 则判定为 GC Rich； 不同情况对引物的要求不一 。 2.生成引物 点击 Generate， 系统会根据序列 GC 含量生成引物 ， 点击 Detail Settings可显示当前用于生成引物的条件 。 然后点击 Display 显示 所 生成的引物 。 如果生成的引物数量过多 ，可对条件适当的缩小以减少引物数量 ： 将 GC%最适条件 50-60%进一步缩小 ； F1c/B1c Tm 值高于其余引物 5 C，可进一步缩小至 3
5、 C 或更少 ； 如 果生成的引物数量过少 ， 可对条件适当放宽以增加可选引物 ： 序列为 AT Rich， 增加引物长度或降低 Tm 值 ； 序列为 GC Rich， 降低引物长度或增加 Tm 值 ； 长度及温度每次最多改变 1 个单位 ，当可生成较多引物时 ，停止改变条件 。 3.引物信息 挑选合适的引物序列 ， 选择 Confirm 进行确认 。 绿色对应 F3/B3 区域 ； 蓝色对应 F2/B2 区域 ； 黑色对应 F1c/B1c 区域 ； 4.选择引物 根据不同序列的自由能要求 ， 排除 不合适的序列 ， F2/B2， F3/B3， F1c/B1c之间的 Tm 值尽量保持一致 。挑选出最适引物后 ， 然后点击 Primer Information保存引物信息 ，用以设计 Loop 引物 。 5.Loop 引物设计 （ 可选 ） Loop 引物可结合 “ 环区域 ” ，从而启动扩增 ，增加 LAMP 的反应速度 。 返回到程序的最初界面 ， 上传 上一步所保存的引物信息 ， 点击 Primer Design。 在新出的界面里会显示前面设计引物 的 信息 ，然后点击 Generate 和Display。 勾选所有的 LoopF 和 LoopB 引物 后 ，点击 Confirm。 选择 LoopF 和 LoopB 3 端自由能 绝对值 都高的作为最佳引物 。
