1、第五章 高级核酸生化,Section 1 DNA结构的多态性（Structural polymorphism of DNA）,（一）核酸的基本构成：5种碱基（A、T、C、G、U）和修饰碱基、磷酸、2种戊糖（RNA中是核糖，DNA中为D-2-脱氧核糖；均为呋喃型环状；C1的异头碳构型为型）其它：RNA中存在部分D-2-O-甲基核糖和Man、Gal等己糖，DNA中有Glc和Man等己糖。但它们不是核酸的骨架成分，而是与碱基侧链连接。,一、概述 (Intoduction）,核糖的构象表示：,五元呋喃环一般是非平面的，有E和T两类折叠方式。 E（信封式）： 五元环中只有一个C原子偏离平面，一般为0.0
2、5nm） T（扭转式）：C2和C3分别以相反的方向偏离平面，其它三原子共平面）。 endo（内式）：偏离平面的原子与C5方向相同， exo（外式）：偏离平面的原子与C5方向相反 书写方法：E式：内式偏离的原子顺序号写在E左上角，右下角为外式。如C2-endo简写为2E； C3-exo写作E3T式：内式偏离的原子顺序号写在T左上角，左下角为外式。若两者偏离程度不等，则大的写在T的右侧。如2T3表示C2-endo、C3-exo，且C3偏离程度大于C2。,核糖的构象表示方法示意图：,（二）核苷及其构象表示：,碱基与核糖通过糖苷键缩合，糖苷键全部为型；糖苷键位置：戊糖的C1与嘧啶的N1或嘌呤的N9之间
3、核苷中碱基平面与核糖平面垂直根据扭转角（嘧啶：O4-C1-N1-C4；嘌呤：O4-C1-N9-C4） 的大小，存在顺式（syn）和反式（anti）两种主要构象。,核苷的顺式与反式：,顺式（syn）：+90 0 -90 反式（anti）：-90 180 +90,（三）核苷酸：,核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化，形成核苷酸（包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸） 脱氧核糖核苷酸： 3和5两种核糖核苷酸：2，3和5三种（四）核酸： RNA和DNA 核苷酸通过3和5磷酸二酯键连接而成。,大量研究表明，DNA是一种动态分子，它依赖于序列的碱基组成、外界环境条件和DNA分子的整体拓扑学性质，可以形成多种变异结构。,二
4、、DNA的空间结构 (Dimensional Structure of DNA),（一）DNA的二级结构,1。单链螺旋（-DNA）： Poly(rC) 或Poly(rA)在酸性条件下一般以双螺旋形式存在；但在pH=7.0的中性或碱性条件下，形成一种右手的、碱基堆积的、A构型的单链螺旋。此外PolyG或PolyI在低盐浓度下也可形成单链螺旋。此类DNA在物化性质和结构特征与蛋白的肽链相似，因称其为-DNA。 -DNA参数： PolyrC：每核苷酸沿轴上升0.311nm，C3-endo/anti构象。 PolyrA：螺旋为右手走向，每核苷酸上升0.282nm，构象亦为A型，每圈9个核苷酸，碱基对轴
5、的倾角为24，反对称方向彼此平行堆积。,Poly （2-methyl-C） Poly（rA）,PolyA (rA)双螺旋中质子化的A+ A+碱基对（右）和Poly(rC) 双螺旋中半质子化的C+C碱基对（左）,2。DNA双螺旋的多态性：,2.1 B型DNA 模式图,两条反平行链以右手螺旋方向绕同一中心轴缠绕形成右手反平行双螺旋； 磷酸与脱氧核糖以3,5磷酸二酯键相连形成DNA外侧骨架；碱基在内侧，两条链间存在碱基互补：A与T或G与C配对形成氢键，称为碱基互补原则（A与T为两个氢键，G与C为三个氢键）； 螺旋有大沟(major groove)和小沟(minor groove)； ； 螺旋的稳定因
6、素为氢键和碱基堆积力； 双螺旋平均直径=2nm，螺距=3.4nm，每圈螺旋包含10bp,B型DNA双螺旋的结构特点：,B型双螺旋DNA的结构特征,碱基配对及氢键形成,T：A,C：G,2.2 DNA的其它双螺旋构象：,(1) A-DNA： 相对湿度92% B 型；相对湿度75% A 型DNA A 型：较宽、短的右手螺旋，碱基倾角19 存在：RNA分子双螺旋区、 RNA-DNA杂交链 (2) Z-DNA： 为左手双螺旋，螺距=4.56nm，每圈12nt。螺旋细长，只有小沟。 磷酸及核糖骨架呈现Z字形走向。 必须含G，且嘌呤碱与嘧啶碱基交替出现，盐或有机溶剂、DNA甲基化，导致B-DNAZ-DNA
7、存在：天然DNA局部区；人工合成寡核苷酸链 (3) C、D、E-型：类似于B 型，属于B-族DNA,major,minor,major,minor,minor,A-族,B-族,（4）P-DNA：,特定的DNA序列在生理条件下可形成由AT碱基对稳定的平行双螺旋DNAP-DNA，其中的两条链呈平行排列。 P-DNA与B-DNA在光谱学、热力学和生物化学性质方面完全不同，生理条件下相当稳定。但在AT序列中参入GC可降低其稳定性。 P-DNA中的碱基为反式Watson-Crick碱基配对方式：A的N6位胺基H与T的C2酮基O形成氢键；糖环为C2-内式G与C之间只产生两个氢键，因此稳定性比Watson-
8、Crick配对差的多：G的N1位H与T的C2酮基O形成氢键; N2位胺基H与T的N3形成氢键。,P-DNA中反式Watson-Crick碱基配对方式,2.3 DNA双螺旋族形相互转换：,3.三链DNA结构（triplet DNA ） ：,3.1 三股螺旋DNA (triple helices ，triplex)： 寡聚嘧啶核苷酸或寡聚嘌呤核苷酸双螺旋，第三条寡聚嘌呤或嘧啶核苷酸（位于大沟中）。1963年由Hoogsteen最早描述。 分类方式有两种： 一是：根据第三条核苷酸链是以Hoogsteen还是反Hoogsteen氢键配对方式结合到双螺旋上，可产生至少两种三螺旋的结构类型：“嘧啶型”和“
9、嘌呤型”。 二是：依照形成方式和生物学意义分为：分子内三螺旋DNA（H-DNA）、分子间三螺旋DNA和平行三螺旋DNA三类。,三股DNA模式：,3.1.1 “嘧啶型”三螺旋DNA：,“嘧啶型”（Py型）三螺旋，或嘧啶-嘌呤-嘧啶（YRY）型三螺旋中，第三条嘧啶链以平行于Watson-Crick双螺旋中嘌呤链的方向，缠绕到双螺旋的大沟上；专一性地与嘌呤链结合。例如，典型的YRY型三螺旋TAT和C+GC，其专一性体现在T对AT，质子化的C（ C+）对GC的识别。这些三螺旋的结构基本单位是嘧啶型三碱基体：TAT和C+GC三螺旋的链3和链2的碱基以两个Hoogsteen氢键配对，不影响链1和链2间的相
10、互作用。,CG * C+C必须质子化,TA * T,结合方式：Watson-Crick + Hoogsteen配对,TA * A TA * T CG * C+ CG * G,3.1.2 “嘌呤型”三螺旋DNA：,“嘌呤型”（Pu型）或嘌呤-嘌呤-嘧啶型（RRY）三螺旋中，第三条嘌呤链以反平行于Watson-Crick双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，专一性地与嘌呤链结合。例如，典型的RRY型三螺旋GGC和AAT；其专一性体现在G对GC、A对AT的识别。 研究发现RRY型三螺旋（CAT、AGC和AAT等）第三条嘌呤链和Watson-Crick双螺旋的嘌呤链以两个反-Hoogsteen氢键相
11、连接，且糖环的二面角限制在anti区。,反Hogstee碱基配对：,弱：TCG 、AGC和CAT,强：GGC、AGC和TAT,3.1.3 分子内三链DNA： (1) H-DNA hinged-DNA）:,也称为铰链DNA ，是一种分子内折叠形成的三股螺旋DNA。当DNA的一段多聚嘧啶或嘌呤核苷酸的组成为镜像重复时，即可在分子内回折产生H-DNA。由于在形成分子内三股螺旋时C需发生质子化过程，故称为H-DNA。H-DNA生物功能: 常出现在基因调控区、DNA复制的起点和终点, 推测与基因表达调控、DNA复制、染色体重组有关。,C：GC,（2） H*-DNA（G：GC）和扭结(nodule) DN
12、A：,在mmol级的Mg 2+和中性条件下，一段多聚嘧啶或嘌呤核苷酸可在分子内回折产生G:GC配对的分子内DNA，称H*-DNA。H*-DNA中GC具有镜像对称，而AT具有逆转对称性。,H*-DNA与扭结(nodule) DNA的形成,对核酸酶和化学探针高度敏感的单链区,对核酸酶和化学探针高度敏感的单链区,嘧啶链,嘌呤链,3.1.4 分子间三螺旋 DNA：,第三条链来自其它分子。,3.1.5 平行三螺旋 DNA（R-DNA）：,在DNA重组时，RecA核蛋白纤维内接合处有3条DNA链，因而形成三链的同源重组的中间体，这种三链复合物被称为R-DNA。 第三条链定义为R链，和双螺旋中的一条链（定义
13、为W-链）相同且平行。 在这种三螺旋中。其对应三碱基体的第三条链上的碱基位置靠近双螺旋Watson-Crick碱基对的二重轴；从而与另外两个碱基都发生相互作用。,R-DNA中的三碱基体：,/ 表示第三个碱基的异构化位置,3.2 三股辫状DNA：,1990年，白春礼等首次采用扫描隧道显微镜（STM）研究了变性-DNA HindIII的微观结构特征，结果观察到了一种新的三链结构三链辫状结构。 在此结构中，3条核苷酸链是彼此穿插而编成辫状结构。其中每条链的核苷酸在组成上一般是不同型的，它们有间隔重复的嘌呤核苷酸片段，使之在辫状结构中作为“穿入”片段。 能量分析结果显示，这种辫状结构模型的总能量（-5
14、313.3kJ/mol）要高于三链螺旋的总能量（-7 275.1kJ/mol），因此，与辫状结构相比，三链螺旋结构可能较为稳定。 目前对于三链辫状结构是否在生物体内存在，还无法做出任何解释和回答，但从结构分子生物学角度看，辫状结构模型无疑对于了解三链的多态性具有积极的作用。,三股辫状DNA模式图：,B型,3.3 三链DNA功能：,（1）三螺旋结构形成可阻止序列专一的蛋白质接近相同或邻近的序列：在质粒中，同型嘧啶与同型嘌呤-嘧啶的结合，阻止了限制性内切酶的切割/或和甲基化酶的甲基化。 （2）三螺旋结构形成可阻止基因的转录和复制：早在1988年，Hogan实验室曾用一个长27个nt的富含嘌呤的寡脱
15、氧核糖核苷酸（ODN），通过形成三链螺旋DNA的方式，与人c-myc基因转录起始位点上游115bp的一个双螺旋靶位点结合，抑制RNA 聚合酶II的转录起始，并在体外观察到Hela细胞核提取物的c-myc基因转录的抑制现象；三螺旋结构还可阻止转录因子Sp1的结合等。类似的现象在大肠杆菌和SV40病毒中也有报道。,（3）三链DNA与重组：在DNA重组过程中，RecA蛋白介导的单链交换过程涉及到平行三链螺旋结构的形成（R-DNA），因此三链结构是生物体内正常生化过程的产物。 （4）可作为精确切割双螺旋DNA靶序列的分子剪刀：通过三链DNA的形成，ODN可作为人造限制性内切酶，专一性精确切割双链DNA
16、，比限制性内切酶的专一性高106倍。 （5）三链DNA与反基因战略：正是由于ODN的三螺旋形成能力，因此可作为反义核酸，用于基因表达的调控过程，或反基因药物。,4. 四链DNA结构与功能：,在生理和实验条件下，富含G的DNA分子可通过单分子折叠或多分子结合的方式，形成不同类型的四螺旋结构。 目前发现的至少有3种四链走向结构：,G4-DNA,G2-DNA或G4-DNA,4.1 通过形成多种G4碱基体而聚合的四链DNA,全平行结构也称为G4-DNA：通过G4碱基体聚合而成的4链DNA主链为平行走向，形成右手螺旋，所有核苷酸为anti，糖环为2-endo构象，4条链对等，有4个相同的沟。 反平行结构
17、I和II可以是两个DNA分子形成发夹后构成（G2-DNA），也可以是一条DNA链折叠形成（G4-DNA），但都属于反平行结构。 反平行结构I：四碱基体相邻的2个G为anti,而另两个为syn，形成1个大沟、1个小沟和2个中沟。 反平行结构II：糖苷键沿每条链仍为交替的anti和syn；G四碱基体中对角线的两个G为anti，而另两个为syn，形成2个大沟和2个小沟。,4.2 含质子化C的四链DNA I-DNA,半质子化的C+C碱基对稳定的双螺旋DNA，通过相互嵌入可形成一种新的四螺旋结构，称为I-DNA。 是富含C的单链DNA分子在酸性条件下，可形成的普遍特征结构。,4.3 四链DNA的生物学功
18、能：,4.3.1 四链DNA与端粒（telomere）端粒是真核染色体的物理端点，是由具有同样DNA序列的短的重复片段组成的，作用是保护基因不会因年龄增长而受到损坏。衰老和癌症都与端粒的作用受到破坏有关。 富含鸟嘌呤碱基的DNA序列能够通过鸟嘌呤环的互联作用形成四链螺旋结构G-四链体。G-四链体由于能够抑制端粒酶的活性而成为抗肿瘤药物的新靶点,能促使G-四链体形成或稳定该结构的物质则可能对癌症有潜在的治疗意义.,端粒DNA序列形成的四链结构中，DNA折叠与以前发表的含钠结构有根本的不同。这一新的DNA结构说明，端粒折叠和展开有一个直接的路径。近来发现4种DNA解旋酶能解旋G一四链体结构 ，其中
19、Sgs l解旋酶最为引人注意，因为其解四链体能力比解双链螺旋强10倍 ，这提示细胞内可能存在消除G-四链体结构的机制。 更重要的是，G 四链体可能为一正常结构，其在细胞内可自行聚集和解聚。由于在复制、重组、转录和端粒DNA延长过程中，双链DNA在细胞内会短暂地分离为单链，因此为富含G的DNA链形成G一四链体提供了机会。,真核细胞染色体末端膨大结构，即端粒，是由简单的重复序列构成： 5-(TxGy)n-3-(AxCy)n-x、y = 1-4；n=20-100，哺乳动物n可超过15000。人的端粒DNA重复序列至少有三种为：TT(G)4； TT(G)3； TTA(G)4，重复1000-1700次。
20、 端粒DNA 3-末端为含G链，一般比5-末端长12-16nt； 低等真核生物端粒较短，3-单链区与特异蛋白结合； 高等真核生物的3-单链区隐藏于T-环结构中；哺乳类T环DNA与两个蛋白TRF-1和TRF-2（telomere repeat binding factor)结合。,端粒的结构:,Proposed structure of T loops in telomeres. The single-stranded tail synthesized by telomerase is folded back and paired with its complement in the duple
21、x portion of the telomere. The telomere is bound by several telomere-binding proteins, including TRF1 and TRF2 (telomere repeat binding factors).,Electron micrograph of a T loop at the end of a chromosome isolated from a mouse hepatocyte. The bar at the bottom of the micrograph represents a length o
22、f 5,000 bp.,为避免端粒的降解、端端融合、重排和丢失而引起基因不稳定和细胞衰老，维持单链突出的完整性是细胞存活所必须的，而G 四链体的形成提供了保护3-末端突出的可能的分子机制。 一种模型认为：富含G的单链重复亚单位(TTAGGG)可自身折回，通过G-G碱基对，形成发夹型结构，而两个来自不同染色体的发夹型结构相互结合形成G-四链体，故称“hairpin-hairpin G - 四链体”。 另一模型认为：3-末端突出通过几次折叠形成分子内的自身折叠型G-四链体，这种结构很可能出现在DNA复制阶段中一段较长的单链重复末端短暂存在时 。,4.3.2 四链结构的功能：,（1）端粒的保护和延长
23、： 可使端粒延伸的端粒酶为反转录酶，其蛋白质组分具有催化活性，RNA组分的4351序列共9个碱基片段为模板，以端粒3-末端为引物，合成端粒重复序列。 端粒酶的延长作用涉及一个重复的易位步骤：延长了的端粒DNA被从RNA上置换出来，其可能的机制是，端粒DNA短暂地形成自身折叠型G-四链体结构，从而提供牵引力以置换及帮助DNA底物和RNA模板所形成的碱基对向后移动一个重复序列；其后，在端粒DNA和RNA重新配对进行下一个延长循环前，G-四链体又解聚为一单链。 目前发现G-四链体结构的稳定剂(如K+ 和BSU1051)在每延长4个重复序列后可引起周期性停顿，而抑制端粒酶的活性。该结果支持了上述端粒延
24、长的模型设想。因此，由端粒DNA所形成的G-四链体成为开发端粒酶抑制剂的新靶点。,（2）转录调节：,某些重要基因的启动区，例如人或鸡-珠蛋白基因、兔前胰岛索原II基因、腺病毒血清型2、视网膜神经蚀质瘤敏感性基因和c-Myc基因中，皆发现有富含G的重复序列，因此它们都具有形成G-四链体DNA结构的可能性 ；此外一些肿瘤基因启动区也具有富含G的重复序列。这些发现促使研究人员推测G-四链体在基因转录调节过程中起一定作用。 另外，G-四链体能阻断RNA聚合酶 。因此当基因密码区的富含G重复序列形成G-四链体，而又不易解聚时，可能会起到抑制RNA聚合酶的作用，从而引起早期转录的停止。,（3）其它功能：,
25、除端粒保护和转录调节外，G四链体可能还与染色体的排列重组和与DNA复制相关的疾病有一定的关系。 富含G重复序列形成G-四链体不仅提供了重组过程中染色体排列的机制，同时也会促使DNA发生异常重组 。 两类重组因子人BLM解旋酶和酵母Sgs 1解旋酶已被证实具有解旋G-四链体的作用 。在缺乏这些解旋酶的细胞中，同源染色体之间相互交换水平升高，染色体不稳定。说明细胞内的解旋酶可能被用来分解不需要的G四链体，以防止异常重组和其它基因的不稳定性。,5. 分支DNA： 5.1 三向接合DNA,三向接合DNA是最简单、最普遍存在的分支结构 特点：除了S3的T6外，其它核苷酸都是反式构象；未配对的T6和T7暴
26、露于溶剂，位于螺旋1-3的小沟中；所有的3个螺旋臂都是B-型；Mg 2+是结构形成所必需。,5.2 非线性多支链结构：,在镁离子存在下，DNA分子可以形成多支链结构，如非对称三臂分支结构，包括T-型和Y-型；以及五臂和六臂多支结构等。,(二) DNA的三级结构, DNA的三级结构:指DNA分子(双螺旋)通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。 超螺旋型(superhelix 或supercoil) DNA： 是DNA的三级结构的一种形式，指DNA双螺旋链再 盘绕形成超螺旋结构正超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负
27、超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方同相反,绝大多数原核生物的DNA是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋结构。,双链环状DNA （cccDNA）：共价闭环DNA,常呈超螺旋型 开环DNA（ocDNA)：双链环状DNA一条链断开 线型DNA (linear DNA ) ：环状DNA双链断开,1 连环数( L, linking number) :双螺旋DNA互绕数() 2 扭转数(T, twisting number) :螺旋圈数 () B型DNA, 10.4bp/圈3 超螺旋数或缠绕数(W，writhing number, ) ： W = L - T ( = - ) W0 (
28、正超螺旋); W0 (负超螺旋) W=0 (松弛形DNA) 4 比连环差( )或超螺旋密度( )：表示超螺旋的强度 () = (L- L0 )/L0 = (L-T )/T=W/T 拓扑异构体: DNA分子具有相同的结构，但L值不同，称它们为拓扑异构体 拓扑异构酶能够催化它们之间的转换DNA拓扑异构酶 I; DNA拓扑异构酶 II(促旋酶), 环形DNA的一些重要的拓扑学特性：,（三）DNA四级结构：,在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构核小体(nucleosome)。 核小体是染色体的基本结构单位,从DNA到染色体,纤丝（ 每圈6个核小体）,突环(150nm, 75kb/突环),玫瑰花结 (6个突环/结）,螺旋圈(30个花结/圈),染色体(10个螺旋圈/染色体),（四）基因组（genome）,Genome: 一个细胞或病毒的全部遗传信息。 绝大多数基因组为DNA，少数为RNA，朊病毒没有基因组 不同生物基因组的大小差异很大 人类基因组大小：3109bp，其中：30%编码蛋白质（1.5%为外显子，其余为内含子和非编码序列）；45%是转座子（可转移的，长短不一的重复序列）；25%是其它序列（包括3%简单重复序列SSR，重复长度小于10bp；编码RNA的DNA和进化遗迹DNA）,生物基因组,
