1、产品专员 刘永良百迈客生物科技有限公司高通量测序技术的应用-RNA-seq、 DGE、 Small RNA、 Re-sequencingOutline全基因组重测序 Re-sequencing生物信息专用服务器系统 Bioinformatics Server System转录组研究 RNA-seq、 DGE、 Small RNADNA sequence-重测序（ Re-sequencing） Re-sequencing是相对于 De novo测序，对已有参考基因组序列的物种进行较低覆盖度的测序，与参考基因序列相比对，寻找 相似品种之间 的差异。 两大条件-有已经组装好的基因组-待测基因组与参考
2、基因组足够接近 3个细胞质雄性不育系和 3个恢复系； Illumina GAII测序， 338 million 75-bp PE reads， 85.4%的覆盖度； 检测到 2,819,086的变异位点，包括 2,495,052 SNPs, 160,478 insertions和 163,556 deletions， 6.8SNPs kb ； 83,262个非同义突变 SNP位于 16,379个基因中， 3,620个非同义突变 Indel位于 2,625个基因中； 黑安古斯牛（ Black Angus bull ）和荷斯坦公牛（ Holstein bull ），测序深度分别为 22X和 19X
3、； 与 Btau4.0参考序列比对后，检测 7M的 SNP，24%是共有的；检测 790个 CNV；材料： 40个栽培种和 10个野生种；测序深度 15，检测到 650万的 SNP，分析了群体遗传结构；发现了数千个与人工选择相关的候选基因，有些基因与水稻的农艺性状具有重要的相关性。2011发表17株野生大豆和 14株栽培大豆；测序深度 5 ， 90%coverage；通过比对分析 ， 得到 630万的 SNP， 18万的获得和缺失变异 （ PAVs） ；进行了遗传进化分析和单体型预测；对大豆群体遗传学研究 、 分子标记育种 、 新基因的发现奠定了坚实的基础；201020106个中国重要玉米杂交
4、组合骨干亲本；平均测序深度在 5.4；检测到 100多万个 SNP， 3万多个 InDel；分析了玉米骨干亲本的全基因组的单核苷酸多态性、插入 /缺失多态性以及基因获得和缺失变异图谱，从而揭示了玉米中的杂交优势的机制 ;重测序的适用情况 研究材料与测序材料之间存在性状差异 ， 通过重测序可以分析各种类型的变异 （ SNP、 InDel、 CNV） ， 将单个参考基因组的信息扩增为生物群体的遗传特征 ， 揭示其分子机理； 针对骨干亲本 （ 比如构建重组自交系的两个亲本 ） 进行重测序；骨干亲本在育种实践中作用突出 ， 分析其遗传构成 ， 发掘骨干亲本中的重要基因组区段 /基因 /等位基因以实现未
5、来育种目标 ， 为全基因组分子设计育种提供依据 ， 为骨干亲本组配设计提供理论基础； 通过对 （ 微 ） 核心种质资源进行重测序 ， 揭示他们之间的进化学关系 ，进行单体型预测 ， 全基因组关联分析 （ GWAS） 。重测序实验流程全基因组 SNP、 SV检测重测序信息分析内容群体遗传结构和进化分析遗传结构 进化树重测序信息分析内容单体型预测，功能基因定位单体型预测 基因定位重测序信息分析内容重测序技术特点与传统测序方式相比，耗时短、成本低、通量高随着越来越多的基因组被解读，可在越来越多的物种上应用与芯片技术相比，数字化的数据保证结果更准确Outline全基因组重测序 Re-sequencin
6、g生物信息专用服务器系统 Bioinformatics Server System转录组研究 RNA-seq、 DGE、 Small RNARNA sequenceRNA-seq产生背景 转录是一个高度动态和可变的过程，传统的方法只能带来部分的表达图谱，已经不能满足基因调控分析的需求； 为了更加准确的认识不同水平的转录本及可变剪切位点，深刻认识真核生物转录水平的调控； 在新一代的深度测序技术的背景下诞生的一项新技术。with reference with /without reference without reference转录本结构： 5 和3端、 UTR 区、可变剪切、新基因检测差异表达
7、基因，如发育时期、组织、环境处理间构建 Unigene库，开发 EST-SSR和 coding SNPRNA-seq目的及意义改变对真核生物转录水平的认识！ 转录组是相对于基因组而言，是一个活细胞所能转录出来的所有 RNA的总和。 转录组测序是指利用高通量测序技术对组织或细胞中所有的 mRNA反转录成的 cDNA进行测序，全面快速地获得某一物种特定组织在某一状态下的所有转录本。转录组测序 (RNA-seq)RNA-seq之一 -发现可变剪切2008 检测了 15,000个剪切位点，主要来自于内含子； 61%的多外显子基因是由可变剪切产生； 40%的可变剪切是内含子保留（ IR）产生；2012年
8、 3月发表 材料： 17个组织分属于三类乳腺癌（ TNBC, Non-TNBC, and HER2-positive） ； 发现了大量的新基因或新转录本 ，构建出了乳腺癌的完整表达图谱； 分析了三类乳腺癌之间的差异表达基因 ， 鉴定了一系列的乳腺癌的表达调控因子；RNA-seq之二 -发现新基因或新转录本鹰嘴豆，苗期的根和茎组织，成年植株的叶、花芽、豆荚；与其他的植物进行比较，发现了两类特别的基因，一是豆科特有的，另一类是鹰嘴豆特有的；在网络上建立了一个 Unigene数据库，利于该物种的育种或有关基因组学的研究。RNA-seq之三 -构建物种 Unigene库2011年 8月发表麻 开花期取
9、材：幼根、叶、花、发育中的种子、根尖；组装 后的 Unigene进行了基因功能注释；开发 了 770,2个 EST-SSR标记，随机选取了 50个分析了芝麻的多态性。RNA-seq之四 -开发 EST-SSR标记 巴西三叶胶的根尖组织； 组装出了 113,313条 Unigene，开发了 17,819个 EST-SSR； 经过多态性分析，筛选出 30个 EST-SSR，外加发表的 60个 SSR，构建了遗传图谱； 用于后续研究中进行分子标记辅助选择；黑白花牛 （ Holstein cows） 哺乳期 15天和250天取样 7个牛乳样品；检测到了 19,175个基因 （ 70%） ；检测了 10
10、0,734个 SNP， 33,045个 SNP具有多态性 ， 用于后续的分子标记辅助育种；通过 Sanger seq42个候选基因比较了 RNA-seq发掘 SNP的准确性； 81%的 SNP两者都检测到；采用 KASPar Genotyping System 证实了RNA-seq可以有效的开发 coding SNP；RNA-seq之五-开发 SNP标记 材料 :苜蓿 genetype 708和 773，分别提取了茎延伸中和延伸后的 RNA样品； 差异基因表达聚类分析和功能注释（ GO、 KEGG）； 得到了一批可能与细胞壁中不同成分（纤维素和木质素）的组成比例有着重要关系候选基因，为进一步的
11、分子育种打下了基础。S Samuel Yang. Using RNA-Seq for gene identification, polymorphism detection and transcript profiling in two alfalfa genotypes with divergent cell wall composition in stems. BMC Genomics. 2011.RNA-seq之六-差异表达基因分析（不同时期）马铃薯，包含 16个不同的组织；检测并分析了 22,000个基因；分析了组织间的差异表达情况；发现了 18 gene co-expression
12、modules 包含 5,400个基因，其中 30%的基因的功能是未知的；这项研究为马铃薯的进一步研究提供了更多的数据支撑。RNA-seq之七-差异表达基因分析（不同组织）2011年发表胡杨三个样品： Control callus、 Salt-stressed callus、 Desert-grown rees；SOAP De novo组装出 86,777条 Unigene，盐胁迫下 27%的 Unigene差异表达；对差异表达基因进行了 GO、 KEGG注释，主要与水分疏导等相关；分析了 ABA合成与调控有关的基因的差异表达；为研究林木在非生物胁迫下的适应性打下基础；RNA-seq之八-差异
13、表达基因分析 （不同处理 ）材料：杨梅果实在成熟发育期间三个时间点 ， 分析颜色和口感的变化；组装得到 41,239 UniGenes 平均长度在 531 bp；分析发现 3600个基因差异表达 ， 其中 826个上调 ， 1407个下调；涉及花青素合成的基因全部上调；进行了 GO和 KEGG分析 ， 重点分析了碳水化合物和酸的代谢通路 。RNA-seq之九-代谢通路的分析 材料：黄瓜， 10个组织； 通过分析对 8700个蛋白编码基因结构进行了优化， 检测到了 5200个新基因； 这项研究证明了通过转录组测序可以完善基因组注释，利于科研人员搭建序列与生物学功能之间的桥梁。RNA-seq之十-完善基因组的注释
