1、1研究生论文开题报告题目 两种植物抗逆基因挖掘与功能分析 姓 名： 杨 涛 学 号： 201030211010 入学时间： 2010-9 所在学院： 植物科学技术学院 学科专业（类别及领域）： 作物遗传与育种 研究方向： 作物分子育种与利用 指导教师： 赵 昌 平 报 告 主 持 人 : 王 宏 芝 报告时间： 2010-11-9 北京农学院研究生部制年 月 日2填 表 说 明一、开题报告各项内容要实事求是，逐条认真填写，表达要明确、严谨。二、开题报告需用计算机打印，一律 A4 纸双面打印，于左侧装订成册。三、论文开题报告的一级标题 1，二级标题 1.1，三级标题 1.1.1，四级标题 1.1
2、.1.1，标题字体均为小四号黑体加粗;开题报告内容字体为五号宋体,行距为 1 倍行距；参考文献字体为小五号宋体。四、此表填写一式四份，一份交所在学院留存（含电子版） ，一份交指导教师，一份学生自存，一份交研究生部留存（含电子版） 。3联系电话 18701673554 E-MAIL 入学时间 2010-9论文题目 两种植物抗逆基因挖掘与功能分析课题来源 课题性质4一立论依据1、前言植物育种就是人们按照自己的意愿，有目的、有计划地获得人们所需要的植物新品种的过程。主要包括两种情况： (1)从不良性状中把所需要的优良性状（相对性状）分离出来或把位于不同个体的优良性状集中到一个个体上来。 (2)创造
3、具有优良性状的生物新品种。作物育种包括引种、常规系统育种、杂交育种、分子育种及其他育种等多种方法。利用杂种优势的杂交育种方法显著提高了农作物产量，保障了世界粮食安全。上世纪 80 年代我国各种作物育种几乎都还靠外引品种来更新品种，90 年代初以后靠自育品种，其中杂交育种方法为我国水稻、玉米、棉花、油菜等作物育种事业做出了巨大贡献。随 着 生 物 技 术 的 发 展 ， 分 子 育 种 弥 补 了 杂 交 育 种 等 常 规 方 法 纯 化 速 度 慢 、 育 种 周 期 长 等 缺 点 。转 基 因 育 种 是 分 子 生 物 育 种 的 有 效 途 径 ， 加快了作物育种进程、提高作物产量、
4、改善品质和增强抗逆性。然而，转基因育种经过多年的发展虽然育成了上千种作物新品种，但在作物分子生物育种方面，基本没有广适应性、性状稳定能特大面积推广的品种。其根本原因就是缺乏优良的抗逆基因资源。2、抗逆相关蛋白激酶基因研究进展随着后基因组时代的到来，人们越来越认识到生命活动不仅仅关系基因，更与基因翻译后蛋白及蛋白互作密切相关；对生命科学的研究也开始倾向于系统研究。在一系列研究成果和重大发现之后，目前有关植物调控逆境胁迫和生长发育的研究重点逐渐从功能基因转到蛋白激酶等调控基因的鉴定、功能分析及其调控机理等方面。蛋白激酶是一类能够使其它蛋白质磷酸化的酶，其在植物体内是信号传递的重要载体，它们通过催化
5、功能蛋白的磷酸化，导致其构象发生改变，从而调节植物的生长、发育、自交不亲和、雄性不育、抗逆和抗病等多种生理过程；在植物中几乎参与植物生命周期中一切生理调节过程。目前研究表明，蛋白激酶基因约占植物结构基因的 1%-3%。以底物蛋白被磷酸化的不同位点对蛋白激酶进行分类可分为 5 类：（1）丝/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶；（ 2）酪氨酸（Tyr）蛋白激酶；（3）组氨酸（His）蛋白激酶；（4）色氨酸（Try）蛋白激酶；（ 5）天冬氨酰基/谷氨酰基（Asp/Glu）蛋白激酶。目前植物中发现的蛋白激酶以前 3 类为主，尤其以丝/苏氨酸类蛋白激酶居多。而根据催化区氨基酸序列的相似性，又可将其分为 5
6、 大组：AGC 组、 CaMK 组、CMGC 组、PTK 组和其它组。2.1 蛋白激酶的结构 迄今为止发现的所有蛋白激酶其作用方式和功能多种多样，然而在它们的催化区域都具有相似的氨基酸序列。通过对蛋白激酶氨基酸序列的保守性分析发现，催化功能域由大约 250300 个氨基酸残基构成，包括 12 个亚区（如图 1 所示） 。不同类型蛋白激酶的区别主要集中在、亚域，例如：第区丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的保守序列为：Asp-Leu-Lys-Pro-Glu-Asn，而酪氨酸蛋白激酶的保守序列则为：Asp-Leu-Arg-Ala-Asn 或 Asp-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn。2.2 SnRK 蛋
7、白激酶家族蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的许多生理过程中起着重要的作用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等。SnRK 蛋白激酶属于丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶超级家族，由于基因序列的相似性和基因结构的不同，被分为三个亚家族分别是：SnRK1，SnRK2 和 SnRK3 （见图 1） 。SnRK1 是糖信号传导过程中的关键因子，在植物中控制糖和淀粉的代谢，SnRK2 和 SnRK3 亚10家图 1 蛋白激酶 SnRK 家族成员结构简图族由于调节区在 C-末端的高度分散，推测它们的功能是蛋白间的相互作用或是调节激酶的活性。SnRK2 主要受渗透胁迫和 ABA 信号诱导。Sn
8、RK3 又被称为类钙调磷酸酶 B 亚基互作蛋白激酶（Calcineurin B-like Calcium Sensor-Interacting Protein Kinases, CIPK），它们与类钙调磷酸酶 B 亚基相互作用，形成网络介导 Ca2+信号的传导和一系列复杂的外界刺激。近年来，对高等植物 SnRK2 基因家族和 SnRK3 基因家族的研究报道较多。 蚕豆 AAPK 和拟南芥 OST1/SRK2E 都是 SnRK2 家族的基因，已经证实被 ABA 激活，在 ABA 控制气孔关闭过程及相关基因的表达过程中起着一定的作用。小麦 SnRK2 家族基因 TaSnRK2.7 在糖代谢、降低渗
9、透势、增强光系统 II 的活性以及促进植物生根等生理生化过程中起着重要作用。水稻 SnRK2 家族基因OsSAPK 4 的诱导表达可以提高水稻在盐胁迫下种子的萌发率。拟南芥 SnRK2.6 基因通过参与调控主要的逆境胁迫代谢过程和 ABA 信号途径来控制气孔的开度。水稻 SnRK3 家族基因 CIPK1 受冷、光、盐等多种胁迫诱导。上述研究表明，SnRK 家族基因受胁迫诱导表达，在抵抗逆境胁迫过程中起着重要的作用。3、抗逆相关 RNA 结合蛋白基因研究进展真核生物基因表达是一个被高度调控的过程，其主要涉及到三方面：转录、转录后及翻译后。基因表达调控首先就是在转录水平，主要是一些转录因子参与调节
10、在各种内外环境刺激下特定基因RNA 的合成。另外，就是在蛋白质水平的翻译后调控，如激酶磷酸化、泛素连接酶等被公认为能在时空上控制细胞内功能蛋白的产生。然而，对于介于上述两方面之间的转录后调控的认识还特别少。近几年，通过研究低等真核生物如酵母、克氏锥虫等越来越多的发现表明：转录后调控 RNA的作用因子为一系列 RNA 结合蛋白（RNA-Binging Proteins ,RBPs） 。并且， Gygi SP 等、Washburn MP 等通过研究酵母分别在 1999 年、2003 年都发表文章阐明转录的 mRNA 数量与基因的蛋白质数量之间只有很微弱的相关性。 Noe G 等研究表明克氏锥虫基因
11、表达主要通过 RBPs 来进行转录后水平调控。RBPs 在 mRNA 存在的各个主要环节中都发挥着重要作用，如 mRNA 的拼接、转运、定位、翻译及退化等（如下图 2 所示） 。在细胞核内 RBP 结合在 mRNA 前体（Pre-mRNA ）上调节促进内含子的剪切及拼接形成成熟的 mRNA；RBP 还能调节成熟 mRNA 从细胞核转运到细胞质；RBP 能11调节 mRNA 识别定位目标，如 mRNA 识别定位线粒体；RBP 还参与调控 mRNA 的稳定性，调节mRNA图 2 RBPs 参与 mRNA 各环节调控的退化；在调控 mRNA 的翻译过程中 RBP 也发挥重要作用。在这些复杂过程中 R
12、NA 结合蛋白通过与 RNA 相互作用形成核糖核蛋白复合体 (Ribonucleoprotein Complex)，直接或间接地参与了这些过程。RNA 结合蛋白种类很多，估计占细胞编码蛋白的 6-8%，但迄今为止只有为数不多的几种RBP，如 HuR、AUF1、TTP、T1A1 及 CUGBP2 等被证实可特异参与 mRNA 拼接、稳定性、翻译和其他层面的基因调控。在各种生物细胞中, RNA 结合蛋白包括异源核糖核蛋白( Heterogeneous ribonucleoproteins)、小核糖核蛋白( Small Nuclear ribonucleoproteins)、Poly( A) 结合蛋
13、白、叶绿体 RNA 结合蛋白、植物富含甘氨酸 RNA 结合蛋白( Glycine-rich RNA-binding Proteins, GRPs)、哺乳动物富含甘氨酸 RNA结合蛋白和蓝细菌 RNA 结合蛋白等。众多的 RNA 结合蛋白氨基酸序列有一定的同源性，目前已经发现了许多 RNA 结合结构域( RNA-binding domain, RBD)，包括: RNA 识别模体( RNA Recognition Motif, RRM)、KH 结构域、锌指结构( Zinc finger)、RGG box、DEAD/DEAH box、Pumilio/FBF( PUF)、双链 RNA 结构域（doub
14、le-stranded RNA binding domain） 、富含精氨酸模体（Arginine-rich motif） 、Piwi/Argonaute/Zwille( PAZ) domain、Sm-protein 模体。这些结构域各自具有特定的保守序列及不同的功能。很多 RNA 结合蛋白含有 1 个或者更多的相同结构域的拷贝, 而其它一些 RNA 结合蛋白含有 2 个或者更多的不同结构域。在高等植物中，Wilkinson, MF 等发现铁敏感 RNA 结合蛋白能调节 mRNA 的翻译和降解；陈12丹生等发现叶绿体多聚腺苷酸结合蛋白( cPABP) RB47 特异性地与 PsbA mRNA
15、的 5 UTR 结合,并对于该 mRNA 的翻译起重要作用；景润春等实验发现 RRM RNA 结合蛋白基因家族参与了细胞核与细胞质的相互作用，同时, 细胞质雄性不育性的形成与育性恢复均与细胞质内线粒体基因组变异与转录后调控有关；董霞等研究表明富含甘氨酸的 RNA 结合蛋白 GRPs 基因可作为烟草水杨酸代谢途径中的一个标记基因研究其途径对逆境的应答。转录后调控过程涉及的众多蛋白质中最重要的一类是含 RNA 识别基序(RNA recognition motif , RRM)的 RNA 结合蛋白。RRM 通常由 8090 个氨基酸组成, 其中含有 8 个氨基酸和 6 个氨基酸组成的 RNP1 和
16、RNP2 两个结合 RNA 所必需的高度保守的亚基序。富含甘氨酸 RNA 结合蛋白(GRRBPs)是植物中丰度较高的蛋白, 它是一类氨基端有 1 个 RRM 结构域, 而羧基端具可变长度的富含甘氨酸结构域的蛋白。植物中该基因最早在玉米中被克隆，随后相继在拟南芥、烟草、大麦等多种植物中被克隆得到。研究表明, 这种蛋白参与了植物对多种逆境条件的反应调节,如冷害、干旱、水涝、伤害、盐压、外源脱落酸 (AB A )或水杨酸( SA)处理等。在众多植物中研究较多、较深入的是拟南芥的 GRBPs。遗传学和生理学方面的数据提供了清楚的证据表明 GRRBPs 在植物抗逆反应中起重要作用。研究表明拟南芥中的 G
17、RRBP 1、GRRBP2、GRRBP3、GRRBP4、GRRBP7、GRRBP8 基因表达量在低温条件下显著增加。干旱、盐分压力也会引起 GRRBP1、GRRBP4 和 GRRBP7 转录产物不同程度地增加。与低温条件下 GRRBP2 表达量增加相对应,拟南芥 GRRBP2 突变株低温条件下与野生型相比表现出发芽、幼苗生长延迟的现象；而过量表达 GRRBP 2 植株发芽时间提早，幼苗生长更好, 而且对冻害表现出更强的耐受力。4、研究的目的与意义4.1 研究目的本研究拟采用小陕北小麦地方品种和尚头、北京市农林科学院杂交小麦工程技术研究中心选育的光温敏不育系材料 Bs366、前苏联长穗偃麦草和高
18、粱等作为试验材料，采用同源克隆与蛋白质组学的方法旨在挖掘到一批 SnRK 抗逆蛋白激酶家族基因和抗逆相关 RNA 结合蛋白基因，为小麦转基因育种提供广适、有效的抗逆基因资源。4.2 研究意义小 麦 籽 粒 蛋 白 含 量 及 蛋 白 质 与 淀 粉 之 比 最 适 合 人 体 需 要 ， 全 世 界 大 约 1/3 的 人 口 主 要 靠 小麦 为 生 。 全 世 界 约 有 103 个 国 家 种 植 小 麦 ， 是 播 种 面 积 最 大 的 谷 类 作 物 。 因 此 ， 小 麦 在 世 界 粮食 安 全 中 占 有 举 足 轻 重 的 位 置 。在农业生物技术中，无论与细胞工程中的花药
19、培养技术离体组织诱变胚珠和幼胚培养，还是与染色体工程中的原生质体培养胚胎工程相比，转基因技术的研究和开发是最具现实意义的一个优先领域，也是产业化最成功的一项生物技术。但是，从转基因研究开始至今存在一个很突出的问题就是，广适应性的优良抗逆基因资源匮乏。因 此 ， 克 隆 新 的 抗 逆 蛋 白 激 酶 基 因 、 抗 逆 相 干 RNA 结合 蛋 白 基 因 ， 及 通 过 对 这 些 基 因 进 行 序 列 分 析 、 亚 细 胞 定 位 研 究 、 表 达 性 研 究 以 及 转 基 因 拟 南芥 、 烟 草 逆 境 胁 迫 下 的 表 型 研 究 以 明 确 其 生 理 生 化 特 点 和
20、 功 能 ， 从 而 深 入 解 析 植 物 中 抗 逆 相关 基 因 功 能 ， 同 时 为 作 物 抗 逆 分 子 育 种 的 应 用 奠 定 理 论 和 实 践 基 础 ； 为 小 麦 抗 逆 分 子 育 种 提 供丰 富 的 抗 逆 基 因 资 源 。参考文献1 Boudsocq M, Laurire C. Osmotic signal in plants multiple pathways mediated by emerging kinase families J. Plant Physiology, 2005, 138: 1185-1194.2 Nakagami H, Pitzs
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40、 试剂盒提取 RNA，为合成 cDNA 做准备。合成 cDNA:将提取的胁迫 RNA 通过反转录聚合酶链式反应，即 RT-PCR 扩增合成 cDNA。将此 cDNA 作为后续试验克隆新基因的模板 DNA。扩新基因：利用 NCBI（美国国立生物信息中心）等生物学网站及DNAMAN、EditSeq、Primer5 等软件搜索水稻、拟南芥、高粱、玉米和短柄草已经验证功能的抗逆蛋白激酶基因和抗逆相关 RNA 结合蛋白基因，并根据搜索基因的保守域设计引物，最后以合成的 cDNA 为模板进行 RT-PCR 扩新基因。新基因分析：将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收阳性带并送测序公司进行测序。对测序
41、结果进行软件分析和 BLAT 比对，确定为全长基因。1.2.2 基因功能验证实时定量荧光 PCR：提取各种材料的胁迫总 RNA，采用 Real-timeRT-PCR 的方法研究胁迫下目的基因的表达趋势。亚细胞定位：利用基因枪方法轰击洋葱表皮细胞，在共聚焦显微镜下观察，研究目的基因的瞬时表达以分析抗逆蛋白激酶的定位情况。原核表达：构建原核表达载体研究下游蛋白是否磷酸化。基因功能表型初步验证：将获得的全长新基因利用农杆菌介导和叶盘法分别转到拟南芥和烟草中，进行胁迫处理从而对新基因进行初步功能验证。1.3 研究方法本试验拟采取的方法有：1） 、Trizol 试剂盒法提取胁迫总 RNA2） 、反转录
42、RT-PCR 法获得 cDNA 并扩新基因3） 、琼脂糖凝胶电泳法分析新基因4） 、双向电泳法获得差异蛋白5） 、质谱法分析蛋白结构6） 、基因枪法、农杆菌介导法和叶盘法进行转基因研究7） 、洋葱表皮法研究亚细胞定位8） 、原核表达法研究下游蛋白磷酸化9） 、实时荧光定量法研究目的基因表达趋势10） 、植物表达载体法进行目的基因初步功能验证研究161.4 拟解决的关键问题本实验研究过程中拟解决的关键问题是：1.4.1 获得抗逆基因家族基因小麦遗传背景复杂，抗逆转基因研究一直较困难，抗逆基因也是零星个别不成体系，本研究将根据多个已经测序的小麦近缘属植物设计引物，同时多种方法并行来大量扩基因已以获
43、得SnRKs 或 RBPs 基因家族多个或整家族基因并进行功能分析。1.4.2 提高植物表达载体法可信度新基因功能分析由于受到时间限制多在转基因的 T0 或者 T1 代进行功能验证，但是在转基因植株中存在基因漂移、偶然表达等问题，新基因的稳定性及功能就遭质疑。本研究将短间隔时间大量种植拟南芥和烟草进行新基因转化，并且转基因的同时进行阳性植株筛选，在 T3 代植株上进行功能验证。172 拟采取的技术路线、试验方案、可行性分析2.1 技术路线（如图 3 所示）植物逆境胁迫处理胁迫材料总 RNA提取抗逆相关基因保守域分析根据保守域设计引物图 3 试验技术路线简图表达趋势分析实时荧光定量 PCR基因定
44、位分析磷酸化分析转基因功能鉴定亚细胞载体构建原核表达载体构建植物表达载体构建RT-PCR 扩增目的基因全长182.2 试验方案1） 、收集并选取试验材料2） 、种植试验材料并进行胁迫逆境处理同源克隆：试验材料花盆种植，8-10 天后长出 2-3 片叶子，植株到 15cm 左右分别对各个试验材料进行干旱、冷、ABA 和盐处理在各个处理后 0h、2h、5h、10h、24h 分别取各材料叶片 2-4g蛋白质组学研究：选取植物材料进行 10%、15%、20%PEG 和 150 mM、250 mM、350mM NaCl 预处理，挑选抗旱耐盐材料水培挑选的材料并分别对各个试验材料进行干旱、冷、ABA 和盐
45、处理在各个处理后 0h、2h、5h、10h、24h 分别取各材料根、茎、叶各 4-6g3） 、配制试剂4） 、取材，提取胁迫总 RNA 和总蛋白质总 RNA 提取：RNA 提取所用器具均要进行除菌和除 RNA 酶处理。其中小勺、镊子等在 0.1%DEPC水中浸泡 12 小时，用前在酒精灯外焰灼烧；离心管、枪头等用无 RNase 的产品。欲采用Trizol 法：将取材才液氮中研磨成粉，转入 Trizol 离心管中（100mg 材料加 1mL Trizol）剧烈振荡、使用材料与 Trizol 试剂充分混合，室温静置 5min，使核酸蛋白复合物完全分离4,12000rmp 离心 10min,取上清加
46、入 0.2ml 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡混匀，静置 3min4,12000rmp 离心 15min,样品分三层，RNA 主要在上层无色的水相中，将其转入新的离心管在得到水相中加入等体积预冷的异丙醇，混匀后静置 3min，4,12000rmp 离心 10min,弃上清加 1ml 75%乙醇（用 DEPC 处理过的水配制）洗涤沉淀，4,5000rmp 离心 3min,弃上清室温超净台静置干燥（切忌完全干燥，否则不易溶解） ，加适量的 DEPC 处理的水溶解RNA，-80保存备用附：0.1%DEPC 水：0.1%DEPC-ddH 2O 37温育 3-4h，然后 121高压灭菌 20min 备用5）
47、、设计引物，扩增新基因36） 、阳性带胶回收送测序，分析获得全长基因7） 、构建载体8） 、转基因相关实验9） 、新基因功能验证2.3 试验可行性分析本试验可操作依据如下所述：（1） 、本研究小组多年从事同源克隆转基因研究，具备丰富的经验。（2） 、本研究小组具有小麦及其近缘属相关植物抗逆基因同源克隆及转基因功能验证的理论基础与操作经验。（3） 、本研究小组从 2006 年开始进行同源克隆及相关转基因研究，已经克隆到很多抗逆基因。同时，本实验室研究小组具备开展设计试验的仪器设备及支持相关试剂、药品的供应和试验涉及到相关公司服务。3三、研究基础及进度安排1、研究基础1.1 研究小组基础本研究小组
48、已经多年从事转基因相关研究工作，经验丰富。并从 2006 年以来兼顾硕士研究生的培养。近几年取得的主要科研成果如下所示：1） 、刘美英等，TaNAC 提高转基因烟草的抗旱功能，中国烟草学报 J.2010，16（6）： 82-872） 、高世庆等，偃麦草 ErABF1 基因克隆及功能分析，麦类作物学报J.2011,31（2）：194-2013） 、杨颖等，植物 bZIP 转录因子的研究进展，麦类作物学报J.2009,29（4）：730-7374） 、冶晓芳等，植物 NAC 转录因子的研究进展，生物技术通报J.2009,10:20-255） 、唐益苗等，植物抗旱相关基因研究进展，麦类作物学报J.2009,29（1）：166-1736） 、王永波等，植物蔗糖非发酵-1 相关蛋白激酶家族研究进展，生物技术通报J.2010,11:7-187） 、高世庆等，转 GmAREB 基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性，作物学报J.2011,37（6）：982-9908） 、唐益苗等，应用 GISH 与 STS 标记鉴定小麦- 中间偃麦草抗黄矮病端体系，作物学报J.2006,32（12）:1855-18591.2 个人基础本人经过本科和研究生阶段的理论学习，已经掌握了相关试验设计的理论知识；同时在研究生上课期间利用课余时间在实验室学习
