1、,酶在食品中的应用,汇报人：张玉冬,通过合理开发和应用酶制剂及相关酶工程技术可有效提高食品原料的深加工程度、改进食品的加工工艺以及改善食品的风味和品质，从而达到提高产品得率和质量，降低生产成本。,目前，酶技术已广泛应用于食品行业的各个领域，如食品保鲜、制糖工业、酿造工业、焙烤工业、乳制品工业、水果蔬菜加工、肉类及鱼虾类加工、蛋品加工、天然食品添加剂的生产以及改善食品的品质和风味等诸多方面。,一、在食品保鲜方面的应用,食品在加工、运输和保鲜过程中，常易受到氧气、微生物、温度、湿度、光线等各种外界因素的影响，因使食品的色、香、味及营养会发生变化，甚至导致食品败坏，降低食品的食用价值。因此，食品保鲜
2、已是食品加工、运输、保藏中的重要问题，已引起食品行业的广泛关注。,酶法保鲜技术就是利用酶的高效专一的催化作用，防止、降低或消除各种外界因素对食品产生的不良影响，进而达到保持食品的优良品质和风味特色，以及延长食品保藏期的技术。,目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已应用于罐装果汁、果酒、水果罐头、脱水蔬菜、肉类及虾米类食品、低酒度、香肠、糕点、饮料、干酪、水产品、啤酒、清酒、鲜奶、奶粉、奶油、生面条等各种食品的防腐保鲜，并取得了较大进展。,二、在食品加工与生产方面的应用,大多数用途是在原料的加工与食品的生产。应用领域主要包括：淀粉类食品、蛋白质类食品、果蔬类食品、乳制品、饮料、天然食品添加剂等。,1、在
3、淀粉食品的加工与生产方面的应用 2、在蛋白质制品的加工与生产方面中的应用 3、在果蔬食品的加工与生产方面的应用 4、在酿酒工业中的应用 5、在焙烤食品制造中的应用 6、在乳制品工业中的应用,1、在淀粉食品的加工与生产方面的应用,淀粉类食品是含有大量淀粉或以淀粉为主要原料加工的食品。 淀粉在淀粉酶的催化下可以产生葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖浆、麦芽糖醇、糊精、麦芽糊精、低聚糖、果糖等。或可以生成果葡糖浆、环状糊精（通过葡萄糖异构酶、环状糊精葡萄糖苷转移酶等的作用） 现已广泛应用于糖果、冰淇淋、饮料、面包等的加工。,2、在蛋白质制品的加工与生产方面中的应用,蛋白质食品是一种以蛋白质为主要原料加工而成的食
4、品。以天然的大分子蛋白存在的蛋白质往往不具有生物活性或加工性能较差，而经过某些蛋白酶的水解后往往能够提高其生物活性或加工性能。目前较常用的是蛋白酶和乳糖酶。,3、在果蔬食品的加工与生产方面的应用,在果蔬类食品的生产过程中，为了提高产量和产品质量，常常使用各种酶。 水果蔬菜加工用酶中最常用的有果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶等。将酶制剂应用于果蔬加工，主要有以下几方面的作用。,果蔬本身所含有的果胶、纤维素、淀粉和蛋白质等是引起果蔬汁浑浊、褐变等不良因素的主要原因，以传统的压榨和过滤等生产工艺难以使果蔬汁达到较高品质，并且营养成分大量损失。而酶技术的应用，不仅克服了传统加工工艺的缺
5、点，且大幅度增加了果蔬汁的品质。在提高果蔬出汁率方面应用最广泛的酶是果胶酶，其次是纤维素酶。 此外在增香、除异味、提取果胶、真空或加压渗酶法处理完整果蔬和提取蔬菜汁中酶的应用也非常广泛。,4、在酿酒工业中的应用,1、啤酒工业中的应用啤酒以其特有的“麦芽的香味、细腻的泡沫、酒花的苦涩、透明的酒质”为人们所喜爱。由于啤酒含有丰富的氨基酸和维生素, 因此被称为“液体面包”。制麦芽大麦含有全麦啤酒酿造用到的所有的酶, 现在企业用到大量的谷物作为替代品, 所以需要外源酶。而利用现代酶工程技术与传统啤酒酿造技术相结合, 将提高啤酒质量, 降低生产成本, 增加企业效益。酶在啤酒生产中的作用主要有辅料液化、提
6、高发酵度降低双乙酰、改善麦汁过滤、增加- 氨基酸、提高啤酒稳定性、改善膜过滤速度、消除杂菌污染、啤酒除氧等。,2 、白酒和黄酒工业中的应用白酒和黄酒产业是我国的一大传统民族工业, 多年来为我国的国民经济发展作出了较大贡献。现代的白酒和黄酒的生产, 既要保持原酒的风味特色, 又要提高出酒率、简化操作, 这就要求传统生产工艺和现代技术相结合。目前, 酶在这两种酒的生产应用中已经很广泛。,酿酒工业中广泛应用的酶主要是糖化酶、液化酶、纤维素酶、蛋白酶、酯化酶等,具有酶活力强、用量少、使用方便等优点,适量添加可提高出酒率和品质。糖化酶、液化酶是白酒黄酒酿造中主要用酶, 目前流行的生料酿酒和液化法黄酒酿造
7、也主要是利用这两种酶直接将淀粉液化糊化糖化来代替蒸煮作用的原理, 而通过酶的固定化技术将它们固定在载体上, 效果更好, 也是当前研究的热点。,5、在焙烤食品制造中的应用,在一些国家对用化学剂改良法 将作出立法限制，这 就 意味着更 需要用酶 法工艺来生产受欢迎的产品。用作焙烤食品面粉来源的小麦和其他谷物含有一些天 然存在的 酶,这些酶对于谷物的发芽和 生长是必 需的。这 些酶在焙烤工艺中亦十分重要,没有它们,焙烤加工便不可能。这些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。,6、在乳制品工业中的应用,近年, 酶在乳品中的应用已扩展到更广的领域。总的来说,当前在乳制品生产中最常用、最重要的
8、几种酶为蛋白酶主要为凝乳酶、乳糖酶、乳过氧化物酶和脂肪酶等。酶在乳制品中最主要的应用是蛋白酶的应用, 特别是用凝乳酶加工干酪, 以及用乳糖酶将乳糖分解, 以提高有乳糖不耐症的人对乳制品的消化力。乳过氧化物酶保鲜鲜奶和乳制品也已在国内、国际得到了较广泛的应用。,三、在食品添加剂方面的应用,食品添加剂是指用于改善食品品质和风味，以及为防腐和加工工艺的需要而加入食品中的少量化学合成或天然物质，现已成为现代食品行业中不可缺少的部分。,按照食品添加剂的功能不同，可以分为酸味剂、抗结剂、抗氧化剂、漂白剂、膨松剂、着色剂、护色剂、酶制剂、增味剂、营养强化剂、防腐剂、甜味剂、增稠剂、香味剂等二十余类。,随着酶
9、工程技术的迅速发展，作为高效、安全的生物催化剂，酶已在食品添加剂的生产中得到较为广泛的应用。,四、D-塔格糖 3-差向异构酶,D-塔格糖 3-差向异构酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向异构,从而实现D-果糖向D-阿洛酮糖的转化。D-塔格糖 3-差向异构酶家族酶因其底物专一性的不同,被分为D-塔格糖 3-差向异构酶(DTEase酶)和D-阿洛酮糖 3-差向异构酶(DPEase酶)两类。,1、DTEase 家族酶的微生物来源,自1993年,日本学者第一次于Pseudomonas cichorii ST-24中发现一种可以催化己酮糖C-3位差向异构化的酶,命名为D-己酮糖 3-差向异构酶。因其最适底
10、物为D-塔格糖,后重新命名为DTEase酶。随后,又发现另一种潜在的DTEase酶,该酶的最适底物为D-阿洛酮糖,可高效催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的转化,因此被命名为DPEase酶。与DTEase酶相比,DPEase酶对果糖的差向异构活性更高,具有更高的应用价值,所以近年来研究主要集中在DPEase酶上。,2、 DTEase 家族酶的酶学性质,微生物来源不同的DTEase家族酶具有不同的酶学性质。虽然DTEase家族酶的氨基酸序列同源性不高(20%62%),但DTEase家族酶都可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的相互转化,其活性中心,金属离子结合部位和底物结合位点的关键氨基酸残基高度保守。,
11、3、DTEase 家族酶的蛋白质工程,来源于A. tumefaciens和C. cellulolyticum的DPEase酶及来源于 P. cichorii的DTEase酶的晶体结构被揭示。DTEase家族酶具有一个典型的TIM桶状结构,由8个重复的-折叠和-螺旋单元构成(/)8结构。其中包含的金属离子结合位点表明金属离子在催化时对于底物结合有重要的作用可稳定差向异构化过程中生成的烯二醇中间产物。,Clostridium bolteae D-阿洛酮糖3-差向异构酶的蛋白质工程与食品级表达,江南大学 食品生物技术 2014.6,五、,摘要,糖尿病是一种世界性新兴的疾病, 严重威胁人类的健康。研究
12、表明,单一糖类消耗成为糖尿病发病的主要因素之一。因此,利用低血糖应答的甜味剂代替蔗糖成为预防糖尿病的有效方法。,D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体,是一种己酮糖甜味剂,属于稀有糖。 D-阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70%,但其能量仅为蔗糖的0.3%,是食品中理想的代糖品。D-阿洛酮糖具有降低血糖、降低血脂、清除活性氧自由基和神经保护等重要的生理功能。在食品加工过程中,可改善凝胶特性并可产生良好的风味。,D-阿洛酮糖在天然产品中存在较少,但生物催化新技术的开发使D-阿洛酮糖的大规模生产成为可能。,本研究前期利用鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613 进行全细
13、胞反应,确定该菌株具有催化 D-果糖差向异构生成 D-阿洛酮糖的能力,无副产物产生。 在此基础上,对该鲍氏梭菌(C. bolteae)ATCC BAA-613 全基因组中预测的 DPEase 酶基因进行克隆、表达;对 DPEase 酶进行分离纯化、酶学性质、构效关系及分子改造等方面进行研究;实现 DPEase 酶在食品级宿主枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 中表达,并分别基于 Cre/lox 系统和反向筛选标记 mazF 基因,成功构建食品级表达系统。,1、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达,（1）、 C. bolteae DTE
14、ase 酶基因的扩增 （2）、 PCR 产物的克隆 （3）、 C. bolteae DTEase 酶基因的测序及序列分析 （4）、 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶表达质粒的构建 （5）、诱导表达条件的优化 （6）、重组 E. coli 细胞催化 D-果糖差向异构化反应 （7）、 D-阿洛酮糖的鉴定,证明基因CLOBOL_00069 所翻译的假定蛋白,其关键序列与 DTEase 家族酶有很高的同源性,具有相同的保守序列,因此,EDP19602 可能是一种 DTEase 家族酶。,将质粒 pMD-CLOBOL_00069 与载体 pET-22b(+)分别用 Nde I 和 Xho I 酶切后,回收酶
15、切产物的目的条带纯化后进行连接,其构建过程如图 2-8 所示。载体 pET-22b(+)带有C 末端 His-Tag 序列,利用 pET-22b(+)表达的重组蛋白带有 6 个 His 标记,可利用Ni2+-Chelating Fase Flow 亲和色谱柱进行纯化。,2、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的分离、 纯化及酶学性质研究,（1）、 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 亲和层析 （2）、 Superdex 200 (10/300 GL) 凝胶层析纯化结果 （3）、 Superdex 200 凝胶色谱确定 C. bolteae DPE
16、ase 酶的分子量 （4）、 金属离子对 C. bolteae DPEase 酶酶活的影响 （5）、C. bolteae DPEase 酶的最适 pH 及 pH 稳定性 （6）、C. bolteae DPEase 酶的最适温度及热稳定性 （7）、 C. bolteae DPEase 酶的底物特异性及酶反应动力学参数研究 （8）、C. bolteae DPEase 酶的平衡率,C. bolteae DTEase酶亚基分子量约为34 kDa,比预测的分子量33 kDa大约1 kDa,可能是由于在其C端增加6个组氨酸标签。 经过 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow
17、亲和层析柱纯化后,即可获得较纯的目的蛋白。 计算得到目的蛋白分子量约为139 kDa,说明该DTEase酶可能是四聚体。此结果与来源于A. Tumefaciens和C. cellulolyticum等DTEase家族酶中的DPEase酶一致。,该酶的最适反应 pH 为 7.0。中性环境下,酶活损失较低,在 pH 6.07.5的缓冲液中保持 2 h 后,残余酶活可在 90%以上;而在偏酸或偏碱性环境下,其酶活损失较大。 酶的在55的酶活最高当温度60 后,酶活力随温度升高而显著下降,3、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的催化机理初探及分子改造,（1）、 C. bolteae
18、 DPEase 的结构分析及活性位点预测 （2）、 改造位点的确定 （3）、 Ala 扫描定点突变 （4）、催化活性中心关键氨基酸 Glu152 和 Glu246 的定点突变 （5）、底物结合关键氨基酸 Glu158,His188 和 Arg217 的定点突变 （6）、底物识别关键氨基酸 Tyr68 和 Gly109 的定点突变 （7）、 Y68 和 G109 位突变体酶的酶学性质 （8）、双突变体酶 Y68I/G109P 的酶学性质研究,4、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达,（1）、 C. bolteae DPEase 酶基因克隆 （2）、 B.
19、subtilis 重组表达载体的构建与鉴定 （3）、 B. subtilis 重组菌的表达及活性鉴定 （4）、重组 C. bolteae DPEase 酶的分离纯化 （5）、重组 C. bolteae DPEase 酶的酶学性质,5、基于Cre/lox系统的C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的食品级表达,（1）、重叠 PCR （2）、 pP43DPE 载体的克隆 （3）、表达载体 pDGI-7S6 的构建 （4）、表达载体 pDGI-7S6-DPE 的构建 （5）、重组菌B. Subtilis/7S6-DPE 的构建及筛选 （6）、重组菌B. subtilis/lox-DP
20、E, pTSC 的构建及筛选 （7）、重组菌B. subtilis/lox-DPE 的构建及筛 （8）、重组菌B. subtilis/lox-DPE 的发酵曲线,6、基于mazF反向筛选标记的C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的食品级表达,（1）、表达载体 pDGI-DPE 的构建 （2）、重组菌 B. subtilis/REF 的构建及筛选 （3）、重组菌 B. subtilis/DPE 的构建及筛选 （4）、重组菌 B. subtilis/DPE 的发酵曲线,7、结论,1、利用PCR的方法扩增获得C. bolteae ATCC BAA-613的DPEase的基因序列,利
21、用pET-22b(+)表达载体,构建重组质粒,转化表达宿主Escherichia. coli BL21(DE3),成功构建重组菌株E. coli BL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。 2. 对重组菌株 E. coli BL21/ pET-22b(+)-CLOBOL_00069 的诱导表达条件进行研究。结果表明在对数生长中期 OD 值为 1.0 左右后,加入终浓度为 5 g/L 的乳糖,20 条件下诱导 7 h,可达到最大酶活,为 6.1 U/mL 发酵液。利用重组菌株 E. coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069 全细胞进行转化。经鉴定,产物为
22、D-阿洛酮糖,说明C. bolteae ATCC BAA-613 的 DPEase 基因在 E. coli BL21中表达正确并具有转化 D-果糖为 D-阿洛酮糖的能力。,3. 利用 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 亲和层析柱和 Superdex 200 10/300 GL 凝胶柱对 C. bolteae DPEase 酶进行分离纯化,其亚基分子量约为 34 kDa,酶蛋白分子量为139 kDa,证实来源于 C. bolteae 的 DPEase 酶为四聚体酶。C. bolteae DPEase 酶是金属蛋白酶,Mn2+和 Co2+可显著增强酶活。当 Co
23、2+浓度为 0.4 mmol/L 时,C. bolteae DPEase酶获得最大酶活。 4. C. bolteae DPEase 酶的最适反应 pH为7.0,在 pH6.57.5 之间其相对酶活较高,表现出良好的活性。最适反应温度为 55,在 45 以下,该酶较稳定,当温度大于 50 时,酶的热稳定性较差。在 Co2+存在的情况下,酶的热稳定性显著提高。55 时,Co2+的添加可使酶的半衰期延长至原来的 3.6 倍。,5. 研究C. bolteae DPEase酶的底物特异性,发现该酶对D-阿洛酮糖的底物特异性最高,D-果糖次之,其次为D-塔格糖,而对磷酸化的糖基本没有作用。并测定该酶的动力
24、学常数,当以D-阿洛酮糖作为底物时,其Km、kcat和kcat/Km分别为27.4 mM、2935 min-1和107.1 min-1mM-1。该酶对D-阿洛酮糖的Km值远小于其他底物,催化效率kcat/Km较其他底物更大,其说明其对D-阿洛酮糖的亲和性更高,其最适底物是D-阿洛酮糖。因此该酶被鉴定为D-阿洛酮糖 3-差向异构酶。,6. 利用已有的晶体结构信息,利用 SWISS-MODEL 对 C.bolteae DPEase 酶单体的结构进行模拟,利用 Discovery studio 软件对 C.bolteae DPEase 酶和 D-果糖进行对接,获得位于活性中心的关键氨基酸位点为 Gl
25、u158,His188,Arg217,Glu152,Glu246,Y68 和 G109。 突变结果表明,Glu152 和 Glu246 为催化活性中心关键氨基酸,Glu158,His188 和 Arg217 与底物结合有关,68 和 109 位的氨基酸与底物识别有关,影响活性口袋的形成。并成功构建双突变体 Y68I/G109P,该突变体酶对 D-果糖的亲和能力更高,具有更好的热稳定性。,7. 利用 B. subtilis WB800 对 C. bolteae DPEase 酶进行表达,成功构建重组菌株 B.subtilis WB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。该重组菌株无需
26、诱导即可产生 DPEase 酶,18h 时酶活可达到 6.8 U/mL。该酶最适 pH 为 7.0,最适温度为 60,与 E. coli 表达的 DPEase酶酶学性质相似。 结果表明,DPEase 酶可在 B. subtilis 中表达。,8. 利用 Cre/lox 系统成功构建食品级重组菌株 B. Subtilis/lox-DPE,获得的最高酶活可达 6.5 U/mL 发酵液(B. subtilis 1A751/lox-DPE)。其 OD600值可达 12 左右,远高于重组菌 B. subtilis WB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。在启动子 P43的作用下,C. b
27、olteae DPEase 酶基因在对数期及稳定期均可高效迅速的表达。,9. 利用 mazF 基因作为反向筛选标记,成功构建食品级重组菌株 B. subtilis/DPE,获得最高酶活可达6.4 U/mL发酵液(B. subtilis 1A751/DPE),与重组菌B. subtilis/lox-DPE和重组菌 B. subtilis WB800/pMA5-cbdpe 的最高酶活相差不大。其 OD600值可达 12 左右,与 重 组 菌 B. subtilis/lox-DPE 相 同 , 远 高 于 重 组 菌 B. subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。,谢谢,
