1、 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/收 稿 日 期 2007 05 16第 一 作 者 简 介 许 巧 情 (1976 ) ,女 ,湖 北 黄 梅 人 ,博 士 研 究 生 ,讲 师 ,研 究 方 向 为 鱼 类 免 疫 学 与 寄 生 虫 学 .橄 榄 蛏 蚌 不 同 组 织 乳 酸 脱 氢 酶 ( LD H) 和 苹 果 酸 脱氢 酶 ( MD H)同 工 酶 的 电 泳 分 析许 巧 情 ,张 琴 ,李 兵 (长 江 大 学 动 物 科 学 学
2、院 ,湖 北 荆 州 434025)摘 要 为 了 解 橄 榄 蛏 蚌 的 生 化 遗 传 特 性 ,采 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 垂 直 平 板 电 泳 ,研 究 了 橄 榄 蛏 蚌 闭 壳 肌 、 斧足 、 鳃 、 肠 道 、 外 套 膜 中 乳 酸 脱 氢 酶 (LD H) 和 苹 果 酸 脱 氢 酶 (MD H)同 工 酶 的 电 泳 酶 谱 和 活 性 。 结 果 表 明 ,橄榄 蛏 蚌 5 种 组 织 乳 酸 脱 氢 酶 共 检 测 到 5 条 酶 带 ,5 种 同 工 酶 在 闭 壳 肌 中 均 有 表 达 ,在 肠 道 和 鳃 中 只 检 测 到 2种 ,在 外 套 膜
3、中 检 测 到 1 条 酶 带 ;苹 果 酸 脱 氢 酶 检 测 到 4 条 酶 带 ,其 中 闭 壳 肌 含 有 4 条 谱 带 ,鳃 、 斧 足 和 盲 肠具 有 3 条 谱 带 ,而 外 套 膜 具 有 2 条 染 色 很 浅 的 微 弱 带 。 可 见 2 种 同 工 酶 的 分 布 均 具 有 组 织 特 异 性 。关 键 词 橄 榄 蛏 蚌 ( S olenaia oleivora) ;乳 酸 脱 氢 酶 (LD H) ;苹 果 酸 脱 氢 酶 (MD H) ;聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ;同工 酶中 图 分 类 号 Q554 ;Q9591215 + 4 文 献 标 识 码
4、 A 文 章 编 号 1673 1409 (2008) 01 S039 03橄 榄 蛏 蚌 ( S olenai a olei vora)别 名 蛏 蚌 、 蛏 形 蚌 、 香 蕉 蚌 ,属 双 壳 纲 (Bivalvia) 古 异 齿 亚 纲 ( Palaeohet2erodonta)蚌 目 ( Unionida) 蚌 科 ( U nionidae Rafinesque) 珠 蚌 亚 科 ( Unioninae Fleming) 蛏 蚌 属 ( S olenai aConrad) 。 壳 质 薄 、 脆 ,外 形 窄 长 ,似 蛏 形 ,壳 长 约 为 壳 高 的 5. 5 倍 。 此 蚌
5、主 要 栖 息 于 河 流 及 与 湖 泊 相 连 的河 口 处 ,底 层 多 为 淤 泥 ,潜 入 泥 中 穴 居 生 活 。 该 种 为 我 国 特 有 种 ,是 珍 贵 的 贝 类 资 源 ,已 知 在 江 西 鄱 阳 湖 、湖 南 洞 庭 湖 、 江 苏 太 湖 、 河 北 大 清 河 、 河 南 宿 鸭 湖 、 安 徽 巢 湖 、 浙 江 湖 州 和 临 安 有 分 布 。 橄 榄 蛏 蚌 体 大 ,肉 足大 ,肉 味 鲜 美 ,营 养 价 值 高 ,是 人 们 喜 食 的 淡 水 贝 类 ,亦 是 鱼 类 及 禽 类 的 天 然 饵 料 和 家 禽 、 家 畜 的 饲 料 。 近年
6、 来 ,由 于 环 境 恶 化 及 过 量 捕 捞 ,资 源 遭 到 严 重 破 坏 ,如 河 北 大 清 河 在 20 世 纪 50 年 代 就 没 有 发 现 活 的 个体 ,其 他 分 布 区 的 产 量 锐 减 1 。 目 前 ,有 关 橄 榄 蛏 蚌 的 研 究 限 于 营 养 成 分 2 、 滤 水 率 3 、 排 氨 率 和 耗 氧 率 4 及 苗 种 增 养 殖 技 术 ,而 且 贝 类 同 工 酶 的 研 究 较 多 6 10 ,但 关 于 橄 榄 蛏 蚌 同 工 酶 的 研 究 未 见 报 道 。 为 此 ,本研 究 拟 通 过 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 技 术
7、对 橄 榄 蛏 蚌 不 同 组 织 乳 酸 脱 氢 酶 (LD H) 和 苹 果 酸 脱 氢 酶 (MD H) 的同 工 酶 进 行 比 较 分 析 ,得 到 LD H 和 MD H 的 组 织 特 异 性 酶 谱 带 ,为 橄 榄 蛏 蚌 的 生 化 遗 传 特 征 分 析 和 种 质资 源 保 护 提 供 依 据 。1 材 料 与 方 法1. 1 材 料试 验 所 用 橄 榄 蛏 蚌 于 2005 年 12 月 采 自 湖 北 省 荆 门 市 漳 河 水 库 ,健 康 无 病 ,体 长 15 17 cm ,采 后 用清 水 将 表 面 的 污 泥 清 洗 干 净 后 置 于 95 %乙 醇
8、 中 ,然 后 放 在 - 80 低 温 冰 箱 中 保 存 。1. 2 方 法冰 浴 中 解 剖 橄 榄 蛏 蚌 ,取 出 鳃 、 外 套 膜 、 斧 足 、 闭 壳 肌 和 盲 肠 5 种 组 织 于 冰 浴 盆 中 ,用 预 冷 的 p H6. 5 的磷 酸 钾 缓 冲 液 洗 净 后 ,在 冰 浴 下 用 电 子 天 平 称 取 各 组 织 0. 4 0. 5 g ,于 预 冷 的 玻 璃 匀 浆 器 中 ,加 入 1. 0 mLp H6. 5 的 磷 酸 钾 缓 冲 液 ,冰 浴 下 匀 浆 ,匀 浆 液 倒 入 1. 5 mL 塑 料 离 心 管 中 ,置 冰 箱 中 抽 提 3
9、h 后 ,以 高 速 冷冻 离 心 机 (4 ,12 000 r/ min)离 心 20 min ,取 出 上 清 液 于 另 一 支 1. 5 mL 塑 料 离 心 管 ,加 2 滴 1 %溴 酚 蓝溶 液 和 等 体 积 的 40 %蔗 糖 溶 液 ,充 分 混 匀 后 在 4 冰 箱 中 保 存 。 电 泳 分 离 方 法 和 同 工 酶 的 染 色 方 法 均 参照 文 献 11 进 行 ,同 工 酶 活 性 根 据 酶 谱 上 条 带 的 强 弱 确 定 。93长 江 大 学 学 报(自 然 科 学 版 ) 2008 年 3 月 第 5 卷 第 1 期 :农 学Journal of
10、Yangtze University( Nat Sci Edit) Mar12008 ,Vol15 No11 :Agri Sci 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/2 结 果 与 分 析1 2 :盲 肠 ;3 4 :闭 壳 肌 ;5 6 :斧 足 ;7 9 :外 套 膜 ;10 12 :鳃图 1 橄 榄 蛏 蚌 5 种 组 织 的 LD H同 工 酶 电 泳 图 谱 及 模 式 图Figure 1 Electrophoresis zymograms a
11、nd model grams ofdifferent tissue s on LDH in Solenaia oleivora2. 1 橄 榄 蛏 蚌 5 种 组 织 中 乳 酸 脱 氢 酶 ( LD H)同 工 酶 的 电 泳 酶 谱橄 榄 蛏 蚌 5 种 组 织 的LD H 同 工 酶 电 泳 图 谱 如 图1。 由 图 1 可 知 ,LD H 同 工 酶具 有 5 条 酶 带 ,闭 壳 肌 的 酶 带最 多 ,共 计 5 条 ,其 次 是 斧 足 ,为 3 条 ,外 套 膜 最 少 ,仅 1 条 。LD H 的 表 达 具 有 明 显 的 组 织特 异 性 。 LD H24 和 LD H
12、23仅 存 在 于 闭 壳 肌 中 ; 除 了 外套 膜 ,其 他 4 种 组 织 中 均 存 在LD H22 ;LD H25 仅 存 在 于 闭壳 肌 和 斧 足 中 ;在 外 套 膜 中 仅检 测 到 了 LD H21。2. 2 橄 榄 蛏 蚌 5 种 组 织 中 乳 酸 脱 氢 酶 ( LD H)同 工 酶 的 表 达 和 活 性表 1 LD H在 5 种 组 织 中 的 表 达 和 活 性 强 弱 情 况Table 1 The expression and activity of LDH in five tissue s of Solenaia oleivora酶 的 名 称 及 编
13、号 酶 带 名 称 肠 道 闭 壳 肌 斧 足 外 套 膜 鳃乳 酸 脱 氢 酶E. C. 1. 1. 1. 27LD H25 6 6LD H24 7LD H23 7LD H22 7 7 LD H21 7 7 6注 : 7 表 示 强 带 ; 6 表 示 中 强 带 ; 表 示 弱 带 ,表 2 同 。表 1 显 示 了 橄 榄 蛏 蚌 不 同组 织 LD H 同 工 酶 的 活 性 。 由表 1 可 以 看 出 ,闭 壳 肌 中 LD H同 工 酶 的 活 性 远 远 高 于 其 他 4个 组 织 ,尤 其 是 LD H24、 LD H23、 LD H22、 LD H21 的 活 性 较强
14、;其 次 是 斧 足 ,其 中 LD H22和 LD H21 较 强 ;外 套 膜 LD H同 工 酶 的 活 性 最 弱 。2. 3 橄 榄 蛏 蚌 5 种 组 织 中 的 苹 果 酸 脱 氢 酶 ( MD H)同 工 酶 的 电 泳 酶 谱橄 榄 蛏 蚌 5 种 组 织 中 的 苹 果 酸 脱 氢 酶 (MD H)同 工 酶 的 酶 谱 表 型 和 模 式 图 见 图 2。 由 图 2 可 以 看 出 ,1 3 :盲 肠 ;4 5 :闭 壳 肌 ;6 7 :斧 足 ;8 9 :外 套 膜 ;10 12 :鳃图 1 橄 榄 蛏 蚌 不 同 组 织 的 MD H电 泳 图 谱 及 模 式 图F
15、igure 1 Electrophoresis zymograms and model grams ofdifferent tissue s on MDH in Solenaia oleivora橄 榄 蛏 蚌 MD H 同 工 酶 分 布具 有 较 明 显 的 组 织 特 异 性 ,且各 个 组 织 的 活 性 较 高 ,包 括 趋于 阴 极 的 线 粒 体 型 m2MD H和 趋 于 阳 极 一 侧 的 细 胞 质 型s2MD H 2 组 。 m2MD H 是 单态 ,在 每 个 组 织 均 有 表 达 , s2MD H 由 1 3 条 带 组 成 。 虽然 s2MD H22 和 s2MD
16、 H24 均在 各 个 组 织 表 达 ,但 其 活 性 以闭 壳 肌 和 斧 足 的 高 , 而 s2MD H23 仅 在 闭 壳 肌 中 表 达 ,为 闭 壳 肌 的 特 征 性 谱 带 。2. 4 橄 榄 蛏 蚌 5 种 组 织 中 的 苹 果 酸 脱 氢 酶 ( MD H)同 工 酶 的 表 达 和 活 性表 2 显 示 了 橄 榄 蛏 蚌 不 同 组 织 MD H 同 工 酶 的 活 性 。 由 表 2 可 以 看 出 ,闭 壳 肌 和 斧 足 中 MD H 同 工酶 的 活 性 远 远 高 于 其 他 3 个 组 织 ,尤 其 是 s2MD H22 和 s2MD H24 ;肠 中
17、MD H 同 工 酶 的 活 性 最 弱 。04 长 江 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2008 年 3 月 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/表 2 橄 榄 蛏 蚌 MD H在 5 种 组 织 中 的 表 达 和 活 性 强 弱 情 况Table 2 The expre ssion and activity of MDH in 5 kinds of tissues of Solenaia oleivora酶 的 名 称 及 编 号 酶 带
18、 名 称 肠 闭 壳 肌 斧 足 外 套 膜 鳃苹 果 酸 脱 氢 酶( EC. 1. 1. 1. 37)m2MD H21 s2MD H22 7 7 6s2MD H23 - - - -s2MD H24 7 7 - 63 讨 论3. 1 不 同 组 织 乳 酸 脱 氢 酶 的 组 织 差 异理 论 上 ,同 一 生 物 体 的 每 一 种 组 织 的 每 一 个 细 胞 ,对 于 某 一 种 酶 或 蛋 白 ,具 有 相 同 的 遗 传 表 达 的 潜 能 ,但 这 种 潜 能 并 不 一 定 在 生 物 的 整 个 生 命 过 程 中 ,在 所 有 的 组 织 和 细 胞 中 都 能 实 现
19、,即 由 于 基 因 表 达 的 时 间和 空 间 上 的 调 控 ,使 得 生 物 基 因 产 物 的 表 达 存 在 着 发 育 过 程 中 的 变 化 和 细 胞 组 织 间 的 差 异 11 。乳 酸 脱 氢 酶 是 参 与 糖 酵 解 的 关 键 酶 ,可 使 细 胞 在 氧 气 不 足 时 仍 能 进 行 正 常 的 生 理 活 动 。 本 研 究 表 明橄 榄 蛏 蚌 闭 壳 肌 和 斧 足 中 LD H 同 工 酶 的 分 布 和 活 性 均 高 于 其 他 3 个 组 织 ,且 分 布 具 有 组 织 特 异 性 ,说 明这 2 种 组 织 中 糖 酵 解 的 反 应 进 行
20、 得 非 常 活 跃 ,这 与 2 种 组 织 的 新 陈 代 谢 活 跃 、 能 量 需 求 大 是 一 致 的 ,因 为闭 壳 肌 和 斧 足 主 要 功 能 是 运 动 ,即 分 解 糖 类 等 物 质 ,产 生 能 量 以 提 供 肌 肉 完 成 运 动 。 这 种 明 显 的 组 织 特 异性 与 黄 海 11 的 研 究 结 果 一 致 ,而 与 李 太 武 等 7 ,8 对 泥 蚶 和 缢 蛏 LD H 研 究 结 果 不 一 致 。有 资 料 显 示 乳 酸 脱 氢 酶 LD H 在 海 水 贝 类 组 织 中 无 活 性 或 活 性 极 弱 10 ,12 ,13 ,本 研 究
21、 也 发 现 了 这 种 现象 ,LD H 除 了 闭 壳 肌 和 斧 足 活 性 较 强 外 ,在 肠 道 、 外 套 膜 和 鳃 中 的 活 性 均 非 常 弱 ,所 以 MD H 成 为 贝 类 新陈 代 谢 中 不 可 缺 少 的 酶 类 之 一 ,贝 类 代 谢 所 需 的 能 量 多 来 源 于 柠 檬 酸 循 环 途 径 ,所 以 乳 酸 脱 氢 酶 同 工 酶 的含 量 很 低 。3. 2 不 同 组 织 苹 果 酸 脱 氢 酶 的 组 织 差 异苹 果 酸 脱 氢 酶 催 化 苹 果 酸 脱 氢 生 成 草 酰 乙 酸 ,它 的 作 用 主 要 是 使 苹 果 酸 脱 氢 ,
22、其 含 量 影 响 糖 的 有 氧 代谢 的 进 行 ,生 成 A TP 的 量 也 相 应 起 变 化 ,且 还 与 葡 萄 糖 异 生 过 程 有 联 系 ,它 是 机 体 受 到 胁 迫 时 为 机 体 提供 能 量 的 重 要 酶 之 一 。苹 果 酸 脱 氢 酶 为 二 聚 体 酶 ,有 移 动 较 快 的 细 胞 质 型 ( s2MD H) 与 移 动 较 慢 的 线 粒 体 型 ( m2MD H) 。 李广 丽 等 14 研 究 表 明 马 氏 珠 母 贝 8 种 组 织 中 MD H 在 各 组 织 显 现 2 4 条 谱 带 ,且 个 别 组 织 间 有 明 显 差 异 。M
23、D H 在 闭 壳 肌 、 足 和 心 脏 的 染 色 最 深 ,这 是 与 肌 肉 的 收 缩 需 要 大 量 能 量 有 关 ,而 心 脏 含 大 量 的 线 粒 体 和良 好 的 血 液 供 应 ,因 此 它 的 代 谢 特 别 需 要 氧 气 和 能 量 ;马 氏 珠 母 贝 外 套 膜 的 MD H 的 含 量 和 活 性 都 极 高 。由 于 MD H 与 珍 珠 质 的 形 成 有 关 ,故 马 氏 珠 母 贝 是 一 种 优 良 的 育 珠 蚌 。 王 静 等 10 对 三 角 帆 蚌 和 池 蝶 蚌 的同 工 酶 研 究 表 明 ,三 角 帆 蚌 MD H 酶 谱 较 简 单
24、 ,只 有 2 条 主 带 ,存 在 年 龄 和 组 织 差 异 。 池 蝶 蚌 MD H 酶 谱共 出 现 12 条 带 ,也 存 在 年 龄 和 组 织 的 差 异 ,由 2 种 类 型 构 成 :m2MD H (线 粒 体 型 ) 和 s2MD H (上 清 液 型 ) ,前 者 主 要 出 现 在 心 、 肾 、 鳃 组 织 中 ,后 者 出 现 于 心 、 肾 、 鳃 、 外 套 膜 和 性 腺 中 。 这 与 本 研 究 的 结 果 基 本 一 致 ,即 组 织 间 MD H 存 在 明 显 的 差 异 。 MD H 在 橄 榄 蛏 蚌 闭 壳 肌 和 斧 足 的 活 性 最 强
25、,这 可 能 与 肌 肉 所 需 的 大量 能 量 在 柠 檬 酸 循 环 过 程 中 ,把 苹 果 酸 转 化 为 草 酰 乙 酸 有 关 ;而 MD H 在 鳃 中 活 性 较 强 与 该 组 织 中 有 大 量血 液 和 丰 富 的 溶 氧 ,从 而 非 常 有 利 于 进 行 TCA 循 环 相 对 应 。 肠 道 中 的 MD H 酶 谱 带 活 性 较 弱 ,可 能 与 该蚌 的 食 性 和 生 活 习 性 有 关 。 MD H 在 体 内 催 化 L2苹 果 酸 脱 氢 为 草 酰 乙 酸 ,草 酰 乙 酸 可 生 成 天 冬 氨 酸 族 的许 多 氨 基 酸 ,而 这 些 氨
26、基 酸 将 参 与 珍 珠 质 的 形 成 ,而 本 研 究 结 果 显 示 外 套 膜 的 MD H 的 含 量 和 活 性 都 极低 ,这 也 间 接 说 明 了 橄 榄 蛏 蚌 不 宜 用 做 育 珠 蚌 。 另 外 橄 榄 蛏 蚌 MD H 酶 谱 为 4 条 ,大 多 组 织 中 为 3 条 酶带 ,与 三 角 帆 蚌 的 较 相 近 10 ;而 比 池 蝶 蚌 10 和 马 氏 珠 母 贝 13 要 简 单 很 多 ,表 明 橄 榄 蛏 蚌 与 三 角 帆 蚌 的 生活 力 和 代 谢 能 力 相 当 ,这 可 能 是 由 于 淡 水 贝 类 和 海 水 贝 类 由 于 生 长 环
27、 境 的 差 异 而 引 起 的 。(下 转 第 46 页 )14第 5 卷 第 1 期 :农 学 许 巧 情 等 :橄 榄 蛏 蚌 不 同 组 织 乳 酸 脱 氢 酶 (LDH)和 苹 果 酸 脱 氢 酶 (MDH)同 工 酶 的 电 泳 分 析 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/参 考 文 献 1 向 建 国 ,周 进 ,金 宏 . 斑 点 叉 尾 鮰 的 生 物 学 与 生 理 生 化 特 性 研 究 J . 湖 南 农 业 大 学 学 报 (自
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36、tion of channel catfish virus DNA in latently infected catfishJ . J Gen Virol ,1999 ,80 :1817 1822.(上 接 第 41 页 )参 考 文 献 1 刘 月 英 . 中 国 经 济 动 物 志 淡 水 软 体 动 物 M . 北 京 :科 学 出 版 社 ,1979. 451 467 2 许 巧 情 ,刘 俊 ,贺 利 容 . 橄 榄 蛏 蚌 含 肉 率 及 肌 肉 营 养 成 分 分 析 J . 淡 水 渔 业 ,2003 ,33 (4) :28 29. 3 许 巧 情 ,刘 俊 ,冯 抗 抗 .
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41、male and male spotted steed were stocked in concrete pond in order to testt he change of body composition between pre2 and post2spawning ,while t he type of spaw2ning was made sure. The result s showed t hat t he content s of crude fat reduced 321 14 %while crude protein rising 13. 19 % t han prespa
42、wning ; ash of f resh muscles didn tchange ;t he decreasing t rend was found in t he moisture. The result s of t he ovum diame2ter dist ribution frequency for Hemibarbus m acul ates females killed during different peri2od in spawning showed t hat t he type of spawning of Hemibarbus m aculates was on
43、espawning a year which was done in several times.Key words : Hemibarbus m acul atus Bleeker ;type of spawning ; reproduction ; body com2position039 Electrophoresis Analysis on LD H and MD H in Different Tissues of Solenaia oleivoraXU Qiao2qing , ZHANG Qin ,LI Bing ( College of A nimal Science , Yang
44、tze Universit y , J ingz hou , H ubei 434025 , China)Abstract : In order to investigate t he biochemistry genetic characteristics of S olenaiaoleivora , by applying t he vertical slab polyacrylamide2gel elect rop horesis , t he zymo2grams of lactate dehydrogenase and malic dehydrogenase isoenzyme we
45、re st udied in fivekinds of tissues ( adductor , feet , branchia , intestinal canal , mantellum ) of S olenaiaoleivora. The result s showed t hat t here were five zymograms of lactate dehydrogenase(LD H) in S olenai a oleivora. All zymograms were scoreable in adductor. Two zymo2grams were detected i
46、n branchia and intestinal canal. One zymograms was detected innantellum. The result s also showed t hat t here were four zymograms of malic dehydro2genase (MD H) in S olenai a oleivora. All zymograms were scoreable in adductor. Thereexisted t hree zymograms in branchia , feet and intestinal canal. H
47、owever , only two low2active zymogram could be seen in t he gel of mantellum. The dist ribution of lactate dehy2drogenase and malic dehydrogenase had apparent tissue specificity.Key words :S olenai a oleivora ; lactate dehydrogenase ; malic dehydrogenase ; polyacryl2amide2gel elect rop horesis042 Ra
48、pid Detection of Channel Catf ish Virus by TaqMan2based Real2time PCR AssayLI Hui2fang ( Fishery College of H uaz hong A gricultural Universit y , W uhan , H ubei 430070 , China)LIU Hong ,LV Jian2qiang , CAI Yi2na S henz hen Ent ry and Exit I ns pection and Quarantine B ureau , S henz hen ,Guang dong 518001 , ChinaTIAN Fei2yan ,LI Xiang2ping ( Fishery College of H uaz hong A gricultural Universit y , W uhan , H ubei 430070 , China)YUE Zhi2qin ( S handong Ent ry a
