基因工程 期末复习题及答案.pdf

1、名 词 解 释 :基 因 工 程 :是 以 分 子 遗 传 学 理 论 为 基 础 ,以 分 子 生 物 学 和 微 生 物学 的 现 代 方 法 为 手 段 ,将 不 同 来 源 的 基 因 (即 DNA 分 子 ),按 照 人 们 预 先 设计 的 蓝 图 ,在 体 外 构 建 重 组 DNA 分 子 ,然 后 导 入 活 细 胞 ,有 目 的 改 造 生 物 原有 的 遗 传 特 性 ,获 得 新 品 种 ,生 产 新 产 品 ,或 是 研 究 基 因 的 结 构 和 功 能 .同 裂酶 (isosc hiz ome r s)(同 切 点 酶 ):有 一 些 来 源 不 同 的 限 制

2、酶 识 别 的 是 同 样 的核 苷 酸 靶 序 列 ,这 类 酶 特 称 为 同 裂 酶 .同 尾 酶 (iso cau d amer):与 同 裂 酶 对 应的 一 类 限 制 性 内 切 酶 ,它 们 虽 然 来 源 不 同 ,识 别 的 靶 序 列 也 各 不 相 同 ,但 都能 产 生 相 同 的 粘 性 末 端 ,特 称 为 同 尾 酶 . 星 号 活 性 (star activ ity ):在 “非 最 适的 ”反 应 条 件 下 (包 括 高 浓 度 的 核 酸 内 切 限 制 酶 、 高 浓 度 的 甘 油 、 低 离 子强 度 、 用 Mn 2 +取 代 Mg 2 +以 及

3、 高 p H值 等 等 ),有 些 限 制 性 核 酸 内 切 酶 识 别序 列 的 特 异 性 便 会 发 生 “松 动 ”,从 其 “正 确 ”识 别 序 列 以 外 的 其 它 位 点 切 割DNA分 子 .这 种 特 殊 的 识 别 能 力 ,通 常 叫 做 星 号 活 性 ,以 Eco RI* 表 示 .测 序酶 是 经 修 饰 过 的 T7 噬 菌 体 DNA聚 合 酶 ,是 采 用 缺 失 的 方 法 ,从 外 切 核 酸 酶结 构 域 中 除 去 2 8 个 氨 基 酸 ,这 样 使 得 T7 DNA聚 合 酶 完 全 失 去 了 3 -5 外 切酶 活 性 ,只 有 5 -3

4、 聚 合 酶 活 性 ,而 且 聚 合 能 力 提 高 了 3 -9 倍 ,测 序 时 常 用 此 酶 .限 制 性 内 切 酶 也 是 一 种 水 解 酶 ,主 要 从 细 菌 中 分 离 得 到 .在 细 菌 体 内 的 作用 是 水 解 “入 侵”的 外 源 DNA 序 列 而 保 护 自 身 DNA.水 解 后 产 生 的 DNA 产 物 是 带 有 5 -P和 3 -OH的 .限 制 性 核 酸 内 切 酶 :是 一 类 能 识 别 和 切 割 双 链 DNA 分 子 中 特定 碱 基 顺 序 的 核 酸 水 解 酶 .限 制 -修 饰 系 统 :指 一 定 类 型 的 细 菌 可

5、以 通 过 限制 性 酶 的 作 用 ,破 坏 入 侵 的 外 源 DNA(如 噬 菌 体 DNA等 ),使 得 外 源 DNA对生 物 细 胞 的 入 侵 受 到 限 制 ; 而 生 物 细 胞 (如 宿 主 )自 身 的 DNA分 子 合 成 后 ,通 过 修 饰 酶 的 作 用 ,在 碱 基 中 特 定 的 位 置 上 发 生 了 甲 基 化 而 得 到 了 修 饰 ,可 免 遭 自 身 限 制 性 酶 的 破 坏 ,这 样 形 成 的 就 是 限 制 -修 饰 系 统 .限 制 性 片 段长 度 多 态 性 (RFLP) 当 DNA序 列 的 差 异 发 生 在 限 制 性 内 切 酶

6、 的 识 别 位 点时 ,或 当 DNA片 段 的 插 入 、 缺 失 或 重 复 导 致 基 因 组 DNA经 限 制 性 内 切 酶酶 解 后 ,其 片 段 长 度 的 改 变 可 以 经 过 凝 胶 电 泳 区 分 ,出 现 的 这 种 DNA多 态性 称 RFLP.载 体 (v ecto r):在 基 因 操 作 中 携 带 外 源 基 因 进 入 受 体 细 胞 的 工具 .克 隆 载 体 :主 要 用 于 扩 增 或 保 存 DNA片 段 ,是 最 简 单 的 载 体 .穿 梭 载 体 :能 在 两 类 不 同 宿 主 中 复 制 、 增 值 和 选 择 的 载 体 .表 达 载

7、体 是 可 携 带 外 源基 因 进 入 宿 主 细 胞 进 行 复 制 并 进 行 转 录 、 翻 译 的 载 体 .YAC 人 工 染 色 体载 体 是 利 用 酿 酒 酵 母 的 染 色 体 的 复 制 元 件 构 建 的 载 体 ,其 工 作 环 境 也 是在 酿 酒 酵 母 中 .YAC基 本 特 点 :YAC 载 体 为 能 够 满 足 自 主 复 制 、 染 色 体 在子 代 细 胞 间 的 分 离 及 保 持 染 色 体 稳 定 的 需 要 ,必 须 含 有 以 下 元 件 :端 粒 重复 序 列 (telo meric rep eat,TEL):定 位 于 染 色 体 末 端

8、 一 段 序 列 ,用 于 保 护 线 状的 DNA不 被 胞 内 的 核 酸 酶 降 解 ,以 形 成 稳 定 的 结 构 .着 丝 粒 (cen tro mere ,CEN):有 丝 分 裂 过 程 中 纺 锤 丝 的 结 合 位 点 ,使 染 色 体 在 分 裂 过 程 中 能 正 确分 配 到 子 细 胞 中 .在 YAC中 起 到 保 证 一 个 细 胞 内 只 有 一 个 人 工 染 色 体 的作 用 .自 主 复 制 序 列 (au to n o mo u sly rep licatio n seq u en ces,ARS):一 段 特 殊 的序 列 ,含 有 酵 母 菌 中

9、DNA进 行 双 向 复 制 所 必 须 的 信 号 .细 菌 人 工 染 色 体 载体 (Bacterial artificial ch ro mo so mes,BACs):是 基 于 大 肠 杆 菌 的 F质 粒 构 建 的 、 高 通 量 底 拷 贝 的 质 粒 载 体 .卸甲 载 体 :将 Ti质 粒 上 的 T-DNA的 致 瘤 基 因 全 部 去 掉 ,仅 保 留 其 两 边 界 即 与T-DNA转 移 所 必 需 的 2 5 b p 序 列 而 构 建 成 的 载 体 .一 元 载 体 :含 目 的 DNA的中 间 表 达 载 体 与 改 造 后 的 受 体 (Ti质 粒 )通

10、 过 同 源 重 组 所 产 生 的 一 种 复 合型 载 体 .双 元 载 体 :是 指 由 两 个 分 别 含 有 T-DNA和 v ir区 的 相 容 性 突 变 Ti质粒 构 成 的 系 统 .Ti质 粒 (tu mo r in d u cin g p lasmid )是 根 癌 农 杆 菌 中 发 现 的 可引 起 植 物 产 生 冠 瘿 瘤 的 质 粒 .T-DNA区 : 即 转 移 DNA,能 转 移 并 整 合 在 植物 细 胞 核 基 因 组 上 的 、 决 定 植 物 形 成 冠 瘿 瘤 的 一 段 DNA.LTS和 RTS对 于T-DNA的 转 移 和 整 合 是 不 可

11、 缺 少 的 .-互 补 ;指 lacZ 基 因 上 缺 失 近 操 纵 基因 区 段 的 突 变 体 与 带 有 完 整 的 近 操 纵 基 因 区 段 的 -半 乳 糖 苷 酶 (-g alacto sid ase,由 1 0 2 4 个 氨 基 酸 组 成 )阴 性 的 突 变 体 之 间 实 现 互 补 .探 针(p ro b e):指 用 于 检 测 特 定 基 因 或 转 录 产 物 存 在 或 表 达 的 DNA、 RNA或 瓜核 酸 序 列 .这 些 序 列 在 使 用 之 前 需 标 记 .基 因 探 针 :指 用 于 检 测 特 定 基 因 或转 录 产 物 存 在 或 表

12、 达 的 DNA、 RNA或 寡 核 苷 酸 序 列 ,这 写 序 列 在 使 用 之前 ,需 要 进 行 标 记 .COS位 点 :当 DNA进 入 细 菌 细 胞 后 ,便 迅 速 粘 性 末 端 配对 形 成 双 链 环 状 DNA分 子 ,这 种 粘 性 末 端 结 合 形 成 的 双 链 区 域 叫 做 COS位 点 .凝 胶 阻 滞 试 验 :(g el retard atio n assay ):又 叫 DNA迁 移 率 变 动 试 验(EMSA),是 用 于 体 外 研 究 DNA与 蛋 白 质 相 互 作 用 的 一 种 特 殊 的 凝 胶 电 泳技 术 .盒 式 诱 变 (

13、cassette mu tag en esis):就 是 用 一 段 人 工 合 成 具 有 突 变 序 列的 DNA片 段 ,取 代 野 生 型 基 因 中 的 相 应 序 列 .这 就 好 象 用 各 种 不 同 的 盒 式磁 带 插 入 收 录 机 中 一 样 ,故 而 称 合 成 的 片 段 为 “盒 ”,这 种 诱 变 方 式 为 盒 式诱 变 .酵 母 双 杂 交 体 系 ( Yeast two h y b rid sy stem):也 叫 相 互 作 用 陷 阱(in teractio n trap ),是 2 0 世 纪 9 0 年 代 初 发 展 起 来 的 分 离 新 基

14、因 的 新 方 法 ,可用 于 分 离 能 与 靶 蛋 白 相 互 作 用 的 基 因 ,也 是 直 接 在 细 胞 内 检 测 蛋 白 蛋白 交 互 作 用 的 灵 敏 度 很 高 的 遗 传 学 新 工 具 .酵 母 单 杂 交 体 系 (y east o n e-h y b rid sy stem)常 用 于 研 究 DNA-蛋 白 质 间 的 相 互 作 用 .酵 母 单 杂 交 体 系 可识 别 稳 定 结 合 于 DNA上 的 蛋 白 质 ,可 在 酵 母 细 胞 内 研 究 真 核 DNA-蛋 白 质间 的 相 互 作 用 ,并 通 过 筛 选 DNA文 库 直 接 获 得 靶

15、序 列 相 互 作 用 蛋 白 的 编码 基 因 .也 可 用 于 分 析 鉴 定 细 胞 中 转 录 调 控 因 子 与 顺 式 作 用 元 件 相 互 作用 .cDNA末 端 的 快 速 扩 增 / RACE (rap id amp lificatio n o f cDNA en d s)是 用于 从 已 知 cDNA片 段 扩 增 全 长 基 因 的 方 法 ,它 根 据 已 知 序 列 设 计 基 因 片 段内 部 特 异 引 物 ,由 该 片 段 向 外 侧 进 行 PCR扩 增 得 到 目 的 序 列 .用 于 扩 增5 端 的 方 法 称 为 5 RACE,用 于 扩 增 3 端

16、 的 称 为 3 RACE.基 因 文 库 :是 指 利用 重 组 DNA技 术 将 生 物 细 胞 的 染 色 体 DNA所 有 片 段 随 机 地 连 接 在 基 因载 体 上 ,然 后 转 移 到 适 当 的 寄 主 中 ,通 过 细 胞 增 殖 而 构 成 各 种 片 段 的 无 性繁 殖 系 .这 种 包 含 某 种 生 物 全 部 基 因 的 一 系 列 无 性 繁 殖 系 称 为 该 种 生 物的 基 因 文 库 .(分 为 :基 因 组 文 库 和 cDNA文 库 .)cDNA文 库 :将 一 种 生 物mRNA,经 反 转 录 产 生 cDNA,以 cDNA构 建 的 克 隆

17、 群 体 叫 做 该 种 生 物 的cDNA文 库 .cDNA差 示 分 析 法 (rep resen tatio n al d ifferen ce an aly sis,RDA)是利 用 PCR能 以 指 数 形 式 扩 增 双 链 DNA模 板 ,而 仅 以 线 性 形 式 扩 增 单 链 模板 的 特 性 ,通 过 降 低 cDNA群 体 复 杂 性 和 更 换 cDNA两 端 接 头 等 方 法 ,特 异性 的 扩 增 目 的 基 因 片 断 .融 合 基 因 :是 指 应 用 DNA 体 外 重 组 技 术 构 建 的 一类 具 有 来 自 两 个 或 两 个 以 上 的 不 同

18、基 因 核 苷 酸 序 列 的 新 型 基 因 .抑 制 性 消 减 杂 交 (Su p p ressio n Su b tractiv e h y b d d izatio n ,SSH):是 一 种 比 较 和分 离 不 同 细 胞 或 同 一 细 胞 在 不 同 状 态 下 差 异 表 达 基 因 的 方 法 .转 化(tran sfo rmatio n ):把 重 组 质 粒 DNA导 入 受 体 细 胞 (大 肠 杆 菌 、 酵 母 、 动 植物 细 胞 等 ),使 其 遗 传 性 状 改 变 的 过 程 . 感 受 态 (co mp eten ce):作 为 受 体 细 胞的 细

19、菌 经 一 定 处 理 (如 冰 冷 的 CaCl2 溶 液 )后 处 于 易 于 接 受 外 源 DNA的 状态 .衔 接 物 是 指 人 工 合 成 的 由 1 0 1 2 n t组 成 的 、 具 有 一 个 或 数 个 在 其 要 连接 到 的 DNA上 并 不 存 在 的 限 制 性 内 切 酶 识 别 位 点 的 平 末 端 的 双 链 寡 核 苷酸 短 片 段 . DNA接 头 (人 工 接 头 )是 指 人 工 合 成 的 含 有 限 制 酶 识 别 顺 序 的核 苷 酸 片 段 .转 化 子 (tran sfo rman t):经 转 化 获 得 外 源 遗 传 物 质 /D

20、NA的 细 胞 :是 向 有 功 能 缺 陷 的 细 胞 补 充 相 应 功 转 染 (tran sfectio n )把 重 组 的 噬 菌 体 或病 毒 导 入 受 体 细 胞 的 过 程 .选 择 (selectio n )是 指 通 过 某 种 外 来 附 加 压 力 (或因 素 )的 辨 别 作 用 ,呈 现 具 有 重 组 DNA分 子 的 特 定 克 隆 类 型 的 一 种 方 法 .筛选 (screen in g )是 指 通 过 某 种 特 定 的 方 法 ,从 被 分 析 的 细 胞 群 体 或 基 因 文 库中 ,鉴 定 出 真 正 具 有 所 需 要 重 组 DNA分

21、子 的 特 定 克 隆 的 过 程 .沉 默 子(silen cer):是 参 与 基 因 表 达 负 调 控 的 一 种 元 件 (降 低 转 录 效 率 的 一 段 DNA)绝 缘 子 (in su lato r):既 是 基 因 表 达 的 调 控 元 件 也 是 一 种 边 界 元 件 .绝 缘 子 本身 对 基 因 的 表 达 既 没 有 正 效 应 ,也 没 有 负 效 应 ,其 作 用 只 是 不 让 其 他 调 控元 件 对 基 因 的 活 化 效 应 或 失 活 效 应 发 生 作 用 .衰 减 子 (atten u ato r):衰 减 发 生处 的 一 种 内 部 终 止

22、 子 序 列 .衰 减 子 结 构 本 身 不 能 实 现 衰 减 作 用 ,必 须 借 助核 糖 体 与 前 导 序 列 的 结 合 来 发 挥 其 作 用 . 终 止 子 (termin ato r):为 转 录 提 供终 止 信 号 的 一 段 DNA序 列 ,是 基 因 表 达 的 顺 式 负 调 控 元 件 .电 转 化 法(electro p o ratio n )也 叫 电 穿 孔 法 或 电 击 法 ,是 一 种 将 极 性 分 子 穿 过 细 胞 膜 导入 细 胞 的 一 种 物 理 方 法 ,在 这 个 过 程 中 一 个 较 大 的 电 脉 冲 短 暂 破 坏 细 胞膜

23、的 脂 质 双 分 子 层 ,从 而 允 许 DNA等 分 子 进 入 细 胞 .菌 落 原 位 杂 交 :将 菌 落或 噬 菌 斑 转 到 固 相 膜 上 ,原 位 裂 解 细 胞 后 使 核 酸 固 定 在 膜 上 ,然 后 与 探 针杂 交 .目 的 基 因 :指 那 些 已 被 或 者 准 备 要 被 分 离 、 改 造 、 扩 增 或 表 达 的 特定 基 因 或 DNA 片 段 .报 告 基 因 :是 指 编 码 产 物 能 够 被 快 速 测 定 、 常 用 于 判断 外 源 基 因 是 否 成 功 地 导 入 受 体 细 胞 (器 官 或 组 织 ),是 否 表 达 的 一 类

24、 特 殊用 途 的 基 因 .报 告 基 因 与 选 择 基 因 的 区 别 :选 择 基 因 往 往 要 与 外 界 存 在 的 筛 选 压 力 如抗 生 素 等 相 互 作 用 ,以 筛 选 出 被 转 化 的 细 胞 ;而 报 告 基 因 是 提 供 一 种 快 速测 定 外 源 基 因 是 否 成 功 导 入 的 检 测 手 段 ,它 的 应 用 不 依 赖 于 外 界 选 择 压力 的 存 在 . 原 位 PCR:是 指 对 组 织 、 细 胞 中 特 异 DNA或 RNA进 行 扩 增 ,然 后再 用 原 位 杂 交 对 扩 增 产 物 进 行 定 量 分 析 的 一 种 方 法

25、.转 基 因 动 物 :指 用 人工 的 方 法 将 外 源 基 因 导 入 动 物 受 精 卵 或 早 期 胚 胎 细 胞 ,使 外 源 基 因 与 动物 本 身 的 基 因 组 整 合 ,并 随 细 胞 的 分 裂 而 增 殖 ,从 而 将 外 源 基 因 稳 定 地 遗传 给 下 一 代 的 工 程 化 动 物 .基 因 工 程 疫 苗 :疫 苗 一 般 是 由 灭 活 或 减 毒 的 病原 体 做 成 的 可 预 防 相 应 病 原 物 引 起 疾 病 的 药 物 , 通 过 接 种 人 或 动 物 在 其体 内 建 立 抗 感 染 免 疫 反 应 而 产 生 保 护 作 用 . 将

26、基 因 工 程 技 术 应 用 于 疫 苗生 产 所 得 的 疫 苗 即 为 基 因 工 程 疫 苗 .亚 克 隆 :对 已 经 获 得 的 目 的 DNA片 段进 行 重 新 克 隆 ,即 将 已 克 隆 的 DNA片 段 从 一 载 体 向 另 一 载 体 的 转 移 的 过程 .目 的 在 于 对 目 的 DNA进 行 进 一 步 分 析 ,或 者 进 行 重 组 改 照 等 .核 酸 疫 苗 :核 酸 疫 苗 又 称 基 因 疫 苗 或 DNA疫 苗 ,是 利 用 基 因 重 组 技 术 将 编 码 抗 原 的基 因 装 入 载 体 ,然 后 直 接 导 入 动 物 体 内 ,通 过

27、机 体 细 胞 的 转 录 系 统 合 成 蛋白 ,产 生 的 蛋 白 作 为 抗 原 诱 导 免 疫 系 统 产 生 免 疫 应 答 ,即 通 过 细 胞 和 体 液免 疫 反 应 产 生 抗 体 ,从 而 达 到 预 防 和 治 疗 疾 病 的 目 的 .动 物 生 物 反 应 器 :从转 基 因 动 物 体 液 或 血 液 中 收 获 基 因 产 物 即 是 所 谓 的 动 物 生 物 反 应 器 质 粒的 不 相 容 性 :两 个 质 粒 在 同 一 宿 主 中 不 能 共 存 的 现 象 .他 们 常 常 共 用 同 一个 复 制 系 统 .转 化 :指 将 质 粒 DNA或 以 它

28、 为 载 体 构 建 的 重 组 质 粒 导 入 受 体细 胞 中 的 过 程 .转 染 把 重 组 的 噬 菌 体 或 病 毒 导 入 受 体 细 胞 的 过 程 .基 因 治疗 能 基 因 ,以 纠 正 或 补 偿 其 基 因 缺 陷 ,达 到 治 疗 目 的 的 方 法 .转 座 子 标 签 技术 /T-DNA标 签 技 术 :当 转 座 子 或 T-DNA转 入 生 物 基 因 组 ,整 合 到 染 色 体 上的 时 候 ,有 可 能 是 插 入 到 染 色 体 上 的 某 个 基 因 中 ,这 时 会 破 坏 该 基 因 的 结构 ,从 而 引 起 表 型 变 异 ,把 变 异 个

29、体 的 DNA提 取 出 来 ,构 建 成 基 因 组 文 库 ,再用 转 座 子 或 T-DNA为 模 板 制 备 探 针 ,克 隆 出 该 突第 一 章 1 .基 因 克 隆 .基 因 操 作 .基 因 重 组 .基 因 工 程 的 概 念 及 其 相 互 关 系 ?基因 克 隆 :在 一 定 程 度 上 等 同 于 基 因 分 离 .基 因 工 程 :通 过 基 因 操 作 来 定 向 改变 或 修 饰 生 物 体 或 人 类 自 身 ,并 具 有 明 确 应 用 目 的 活 动 称 为 基 因 工 程 .基因 操 作 :对 基 因 进 行 分 离 .分 析 .改 造 .检 测 .表 达

30、 .重 组 和 转 移 等 操 作 的 总 称 .基 因 重 组 :不 同 来 源 DNA分 子 通 过 共 价 连 接 (磷 酸 二 酯 键 )而 组 合 成 新 的DNA分 子 的 过 程 .关 系 :基 因 工 程 是 通 过 基 因 重 组 实 现 的 ,但 基 因 重 组 并 不都 是 严 格 意 义 上 的 基 因 工 程 ,基 因 重 组 是 基 因 操 作 范 畴 的 概 念 ,包 括 实 验研 究 和 生 物 技 术 的 基 因 重 组 事 件 ,而 基 因 工 程 则 专 指 为 实 践 应 用 而 进 行的 重 组 事 件 .2 .试 述 基 因 工 程 技 术 的 发

31、展 给 人 类 带 来 的 影 响 ? .在 工 业 领域 的 应 用 (第 四 次 工 业 大 革 命 ) .在 农 业 领 域 的 应 用 .在 医 药 领 域 的 应 用(第 二 次 医 学 大 革 命 )3 .试 述 基 因 工 程 技 术 的 发 展 方 向 ?生 物 的 遗 传 改 良 ,生物 反 应 器 .基 因 治 疗 和 基 因 疫 苗 等 .4 .简 述 基 因 工 程 的 基 本 过 程 ? .提 取 目的 基 因 .目 的 基 因 与 运 载 体 结 合 .将 目 的 基 因 导 入 受 体 细 胞 .目 的 基因 的 检 测 和 表 达第 二 章 1 .切 口 平 移

32、 标 记 DNA前 ,用 DNaseI处 理 DNA时 应 注 意 什 么 ?应 注 意Mg 2 +离 子 浓 度 和 处 理 时 间 及 温 度 .2 .DNA聚 合 酶 有 哪 些 类 型 ,各 有 什 么 活性 ? .E.co liDNAp o lI 5 -3 DNA聚 合 酶 活 性 .5 -3 DNA外 切 酶 活性 .3 -5 DNA外 切 酶 活 性 .E.co liDNAp o lI大 片 段 (Klen o w酶 )5 3 DNA聚 合 酶 活 性 .3 5 外 切 酶 活 性 .T4 噬 菌 体 DNAp o l5 3 DNA聚 合 酶 活 性(与 len o w酶 相 似

33、 )3 5 外 切 酶 活 性 ( len o w酶 2 0 0 ):在 无 d NTP时 只 有该 活 性 .常 用 于 填 平 d sDNA的 3 缩 进 末 端 及 水 解 d sDNA的 3 突 出 末 端 .T7噬 菌 DNAp o l及 测 序 酶 5 3 DNA聚 合 酶 活 性.3 5 外 切 酶 活 性 ( len o w酶 1 0 0 0 ) .耐 热 DNA聚 合 酶 在 高 温 下 仍 具 活性 的 DNA聚 合 酶 .反 转 录 酶 (依 赖 于 RNA的 DNAp o l)5 3 DNA聚 合 酶活 性 (需 Mg 2 +)RNaseH活 性 (5 3 及 3 5

34、RNA外 切 核 酸 酶 活 性 ) .末 端转 移 酶 (termin altran sferase)不 依 赖 于 模 板 的 DNA聚 合 酶 ,在 二 价 阳 离 子 存在 下 ,催 化 d NTP加 在 DNA分 子 的 3 -OH端 .3 .生 产 限 制 性 内 切 酶 的 细 菌 如 何 保 护 自 己 的 DNA不 被 降 解 ?通 过 限 制 与修 饰 系 统 保 护 自 己 的 DNA不 被 降 解 .不 同 种 的 细 菌 或 不 同 的 细 菌 菌 株 具有 的 限 制 酶 和 修 饰 酶 组 成 的 限 制 与 修 饰 系 统 .修 饰 的 本 质 是 通 过 甲

35、基 化酶 将 DNA中 某 些 碱 基 进 行 甲 基 化 修 饰 ,由 于 宿 主 自 身 DNA上 的 这 些 位 点进 行 了 修 饰 ,限 制 酶 就 不 能 进 行 切 割 .由 于 外 来 的 DNA在 相 应 的 碱 基 上 没有 被 甲 基 化 ,宿 主 的 限 制 酶 通 过 对 该 位 点 的 识 别 来 分 辨 敌 我 ,并 将 入 侵 的外 来 DNA分 子 降 解 掉 .所 以 DNA限 制 作 用 和 修 饰 作 用 为 细 胞 提 供 了 保护 .4 .按 适 当 的 顺 序 ,列 出 将 一 种 mRNA的 cDNA克 隆 到 表 达 载 体 所 用 到 的酶

36、有 哪 些 ? 反 转 录 酶 以 mRNA为 模 板 复 制 出 单 链 cDNA; DNA聚 合 酶以 单 链 cDNA为 模 板 合 成 双 链 DNA; S1 核 酸 酶 切 割 双 链 DNA形 成 平 末端 ; 用 限 制 性 内 切 酶 切 割 载 体 ; 用 DNA连 接 酶 将 cDNA插 入 载 体 .5 .某学 生 在 用 Eco RI切 割 外 源 DNA片 段 时 出 现 了 星 号 活 性 ,分 析 可 能 的 原 因 ?(1 )高 甘 油 含 量 (5 ,v /v );(2 )限 制 性 内 切 核 酸 酶 用 量 过 高 (1 0 0 U/u g DNA);(3

37、 )低 离 子 强 度 (3 k b 的 DNA片 段 3 .在 做 So u th ern 印 迹 分 析 时 ,有 同 学 为 了 节 省 时 间 ,做 完 凝 胶 电 泳 这 一 步 ,没 有 根 据 方 案 用 NaOH溶 液 浸 泡 凝 胶 使 DNA变 性 为单 链 ,而 是 略 过 了 这 一 步 直 接 将 DNA从 凝 胶 转 移 至 NC膜 上 ,然 后 用 标 记 探针 杂 交 ,最 后 发 现 放 射 自 显 影 胶 片 是 空 白 的 .试 分 析 该 同 学 错 在 哪 里 ?杂 交探 针 是 双 链 的 ,可 能 因 为 在 加 人 杂 交 混 合 物 之 前 忘

38、 记 将 探 针 变 性 而 得 到空 白 的 放 射 自 显 影 结 果 .4 .建 立 了 一 个 文 库 后 ,如 何 鉴 定 一 个 携 带 目 的 基因 的 克 隆 ?带 有 某 一 细 菌 基 因 的 克 隆 通 常 可 以 直 接 看 出 来 ,因 为 基 因 表 达引 起 了 宿 主 细 胞 表 型 的 可 见 变 化 .然 而 ,真 核 生 物 的 基 因 不 都 表 达 ,则 需 用相 应 的 方 法 来 找 出 带 有 所 需 基 因 特 定 克 隆 .一 个 常 用 方 法 是 杂 交 (1 )从 不同 的 克 隆 提 取 DNA,固 定 于 硝 酸 纤 维 素 滤 膜

39、 上 ,然 后 用 NaOH使 之 变 性 (2 )探 针 必 须 能 与 所 需 的 基 因 互 补 且 被 3 2 p 标 记 .探 针 可 以 是 来 自 另 一 不 同 生物 体 的 相 关 的 基 因 ,或 是 依 据 与 基 因 特 异 相 关 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 设 计并 经 化 学 合 成 的 一 小 段 DNA分 子 (3 )探 针 只 会 与 特 定 基 因 进 行 碱 基 配 对(杂 交 ),冲 洗 滤 膜 后 ,未 结 合 上 的 标 记 探 针 会 被 除 去 (4 )烘 干 滤 膜 后 进 行 放射 自 显 影 后 ,所 需 的 克 隆 就 以 一

40、个 黑 点 在 胶 片 上 显 示 出 来 ,这 就 是 菌 落 或原 位 杂 交 分 析 .5 .单 核 苷 酸 置 换 插 入 或 缺 失 中 ,引 物 设 计 的 要 求 ? 5 端 完 全配 对 ,使 得 上 游 (引 物 )起 始 的 DNA合 成 不 容 易 将 诱 变 寡 核 苷 酸 取 代 ,约 需 8 -1 0 b p .3 端 所 形 成 的 杂 交 体 足 以 引 导 DNA合 成 .如 果 错 配 核 苷 酸 太 靠 近3 端 ,3 端 将 不 能 形 成 稳 定 的 杂 交 体 ,易 被 外 切 活 性 降 解 .所 以 3 端 需 有 9 b p完 全 配 对 .为

41、 便 于 筛 选 ,应 选 用 可 形 成 稳 定 杂 交 体 而 长 度 最 短 的 诱 变 寡 核苷 酸 .一 般 1 7 -1 9 b p ,错 配 在 中 央 ,使 得 完 全 配 对 的 杂 交 体 与 错 配 杂 交 体 之 间的 热 稳 定 性 差 异 足 够 大 .6 .DNA诱 变 有 哪 些 种 类 ,各 有 何 特 点 ? 随 机 诱 变 :目 的 基 因 的 DNA片 段 中 引 入 了 大 量 的 序 列 多 样 性 ,得 到 的 具 体 突 变 体 可以 是 单 点 突 变 也 可 能 是 多 点 突 变 . 寡 核 苷 酸 介 导 的 定 点 诱 变 :寡 核 苷

42、 酸介 导 的 定 点 诱 变 可 以 在 任 何 感 兴 趣 的 位 置 加 上 限 制 性 内 切 酶 位 点 ;能 够把 一 个 自 然 条 件 下 从 未 被 发 现 的 突 变 精 确 放 置 在 靶 基 因 的 特 定 位 置 .7 .DNase I足 迹 试 验 主 要 步 骤 : 用 3 2 P标 记 DNA双 链 末 端 ,并 用 RE切 去 一端 ; 加 入 细 胞 特 定 周 期 蛋 白 质 提 取 物 ,温 育 ; 加 入 适 量 DNaseI或 硫 酸 二甲 酯 -六 氢 吡 啶 ,使 DNA链 发 生 断 裂 .这 一 反 应 中 ,DNaseI或 硫 酸 二 甲

43、酯 的用 量 非 常 关 键 ,要 保 证 一 条 DNA链 只 发 生 一 次 断 裂 ; 沉 淀 DNA(包 括 与DNA相 结 合 的 蛋 白 质 ); 进 行 DNA凝 胶 分 析 .第 五 章 1 .简 述 以 质 粒 为 载 体 构 建 基 因 文 库 的 基 本 步 骤 ? 总 DNA的 提取 ; 载 体 的 制 备 .纯 化 ; 基 因 组 DNA的 不 完 全 消 化 ; 载 体 与 外 源 DNA片 断 的 连 接 ; 转 化 受 体 菌 ,然 后 在 有 选 择 压 力 的 平 板 上 培 养 转 化 了 外 源基 因 的 受 体 菌 ; 重 组 子 的 鉴 定 ; 外

44、源 DNA进 行 分 析 .2 .构 建 了 基 因 文 库后 ,有 哪 些 方 法 可 以 筛 选 或 鉴 定 出 哪 一 个 克 隆 可 能 含 有 目 的 基 因 ? 表 型筛 选 法 :是 在 宿 主 菌 (大 肠 杆 菌 )中 表 达 目 的 基 因 ,使 宿 主 产 生 新 的 表 型 或 使宿 主 恢 复 其 突 变 基 因 的 表 型 来 筛 选 目 的 基 因 . 用 核 酸 探 针 筛 选 目 的 cDNA(基 因 ):对 欲 克 隆 的 基 因 序 列 了 解 时 ,以 目 的基 因 的 部 分 序 列 (DNA片 段 )制 备 探 针 ,对 文 库 进 行 筛 选 .

45、免 疫 筛 选 (抗 体筛 选 )目 的 基 因 :如 果 能 够 得 到 目 的 基 因 产 物 的 抗 体 ,就 可 以 通 过 免 疫 学 的方 法 来 筛 选 目 的 基 因 .其 使 用 的 探 针 不 是 核 酸 ,而 是 特 异 性 抗 体 . 利 用 数据 库 鉴 定 基 因 :将 DNA序 列 输 入 Gen Ban k 与 已 知 的 基 因 序 列 进 行 比 较 .酵 母 双 杂 交 系 统 鉴 定 基 因 :是 根 据 真 核 生 物 转 录 调 控 特 点 创 建 的 一 种 体内 鉴 定 基 因 的 方 法 ,其 筛 选 的 基 因 不 是 “探 针 ”的 直 接

46、 编 码 产 物 ,而 是 能 够与 其 相 互 作 用 的 蛋 白 质 的 编 码 基 因 ,即 筛 选 与 已 知 基 因 产 物 发 生 相 互 作用 的 蛋 白 的 编 码 基 因 .3 .在 基 因 工 程 中 ,为 了 在 细 菌 细 胞 中 表 达 真 核 生 物的 基 因 产 物 ,为 什 么 通 常 要 用 cDNA而 不 用 基 因 组 DNA?为 什 么 要 在 cDNA前 加 上 细 菌 的 启 动 子 ?cDNA是 mRNA的 反 转 录 产 物 ,与 基 因 组 DNA相 比 ,没 有 了 启 动 子 和 内 含 子 .因 为 细 菌 没 有 内 含 子 剪 接 系

47、 统 ,并 且 不 能 识 别 真核 生 物 的 启 动 子 ,所 以 要 使 用 cDNA.有 因 为 cDNA上 没 用 启 动 子 ,所 以 要 加上 细 菌 的 启 动 子 ,保 证 其 能 正 确 转 录 .5 .扣 除 杂 交 ?其 基 本 原 理 是 ?概 念 :将含 目 标 基 因 的 组 织 或 器 官 的 mRNA 群 体 作 为 待 测 样 本 (Tester),将 基 因 表达 谱 相 似 或 相 近 但 不 含 目 标 基 因 的 组 织 或 器 官 的 mRNA 群 体 作 为 对 照 样本 (Driv er),将 Tester 和 Driv er 的 cDNA 进

48、 行 多 次 杂 交 ,去 掉 在 二 者 之 间 都表 达 的 基 因 ,而 保 留 二 者 之 间 差 异 表 达 的 基 因 . 原 理 :一 种 细 胞 的 总 mRNA反 转 录 制 备 的 cDNA 与 另 一 细 胞 的 总 mRNA 混 合 形 成 cDNA-RNA 杂 交分 子 通 过 羟 基 磷 灰 石 柱 被 扣 除 ,未 杂 交 的 单 链 cDNA 流 出 柱 子 外 ,其 对 应的 低 丰 度 mRNA 得 以 克 隆 .1 1 .如 何 以 E.co li质 粒 DNA为 载 体 克 隆 一 个 编码 动 物 激 素 的 基 因 并 使 之 在 E.co li中

49、进 行 表 达 ?简 要 说 明 实 验 中 可 能 遇 到的 问 题 及 可 能 的 解 决 办 法 ?要 使 动 物 中 编 码 激 素 的 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 表达 ,通 常 遇 到 的 问 题 有 :(1 )细 菌 的 RNA聚 合 酶 不 能 识 别 真 核 生 物 的 启 动 子 .(2 )大 多 数 真 核 基 因 有 内 含 子 ,这 些 内 含 子 在 转 录 后 从 前 体 mRNA中 被 切除 而 形 成 成 熟 mRNA.细 菌 细 胞 没 有 这 样 的 机 制 来 去 除 内 含 子 .(3 )有 些 真核 生 物 的 蛋 白 质 是 通 过 前 体 分 于 加 工 而 来 的 ,例 如 胰 岛 素 就 是 通 过 加 工去 除 前 体 分 子 内 部 的 3 3 个 氨 基 酸 残 基 而 来 ,剩 下 的 两 段 肽 链 分 别 形 成 胰岛 素 的 a.b 链 .(4 )产 生 的 真 核 生 物 的 蛋 白 质 产 物 可 以 被 细 菌 的 蛋 白 酶 所 识别 和 降 解 .针 对 上 述 可 能 出 现