1、福建农林植物保护学院农药残留检测分析校内实训报告姓 名：林亮学 号：102251002064成 绩：指导老师：廖金英实习地点：福建农林大学制药工程专业实验室（下安实验楼 3 号楼 6 楼）实训时间：2013.6.291 目的与意义（1）掌握用标准曲线法测定待测液的浓度。（2）了解高效液相色谱仪操作时的一些注意事项(3) 了解对农药残留进行检测与分析的目的掌握用标准曲线法测定待测液的浓度。（4）熟悉并掌握高效液相色谱仪检测的操作流程。（5）熟悉并掌握高效液相色谱仪的主要结构组成2 实训内容2.1 样品预处理2.1.1 试样制备试样为含未知浓度的毒死蜱水样。2.1.2 提取量取 5mL 水样加入分
2、液漏斗中，并加入 20mL 乙酸乙酯置分液漏斗，充分震荡，静置分层，收集上层乙酸乙酯相，下层水相再用 10mL、10mL 乙酸乙酯同上法萃取两次，收集上层乙酸乙酯，加入 2-5g 无水硫酸钠脱水，加入少量活性炭脱色。重复三次。2.1.3 净化收集提取液，在 60-70水浴旋转蒸发器中，浓缩至 2-3mL，并且用乙酸乙酯定容。2.2 添加回收实验操作步骤在 20mL 水中，分别加入 2L、20L 和 200L 的 10000mg/L 的毒死蜱溶液，吸 2mL 于分液漏斗中，先用 10mL 乙酸乙酯萃取，充分震荡，静置分层，收集上层乙酸乙酯相，下层水相再用 5mL、5mL 乙酸乙酯同上法萃取两次，
3、收集上层乙酸乙酯，加入 2-5g 无水硫酸钠脱水。而后进行浓缩，操作方法与样品处理相同。2.3 高效液相色谱检测2.3.1 高效液相色谱仪工作原理高效液相色谱仪（HPLC ）包括溶剂传输系统 (泵 )、进样器、色谱柱、检测器和流动相五个部分。HPLC 分离是利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，当试样随着流动相进入色谱柱中后，组分就在其中的两相间进行反复多次的分配（吸附脱附放出）由于固定相对各种组分的吸附能力不同（即保存作用不同） ，因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组
4、分的色谱峰。2.3.2 高效液相色谱仪操作流程（1）过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 （2）对抽滤后的流动相进行超声脱气 10-20 分钟。（3）打开 HPLC 工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 （4）进入 HPLC 控制界面主菜单，点击 manual，进入手动菜单。 （5）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在 manual 菜单下，先点击 purge，再点击 start，冲洗时速度不要超过 10?ml/min。 （6）调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压
5、力越大，一般不要超过 2000。点击 injure，选用合适的流速，点击 on，走基线，观察基线的情况。 （7）设计走样方法。点击 file，选取 select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击 new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击 protocol。一个完整的走样方法需要包括：进样前的稳流，一般 2-5 分钟；基线归零；进样阀的 loading-inject 转换；走样时间，随不同的样品而不同。 （8）进样和进样后操作。选定走样方法，点击 start。进样，所有的样品均需过滤。方
6、法走完后，点击 postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 （9）关机时，先关计算机，再关液相色谱。2.3.3 高效液相色谱仪使用注意事项（1）操作泵时，必须对溶剂进行脱气 。（2）使用缓冲溶液之后一定要用水清洗。（3）启动泵之前要灌泵，检查泵压。（4）使用进样针前要清洗干净，并去除气泡。（5）清洗进样针时应选择样品易于溶解的溶剂。（6）使用自动进样器针管清洗溶液时要格外注意。（7）保证样品溶液与流动相之间的可混合性。（8）作为新色谱柱，最好在使用前，低于分析流速下（0.2-0.3ml/min ）过大约 30 分钟。（9）关机时，最好逐步降低流
7、速，不要突然降低压力，这样对色谱柱以及系统都会有影响。（10）当使用缓冲溶液时，切记要先用水冲洗系统，再改用有机溶剂，这样可以避免结晶现象出现，堵塞柱子。（11）使用前，最好过滤流动相及样品，避免颗粒物产生堵塞。（12）样品最好溶解在流动相中，如果不是，最好也要接近流动相的组成。这样会减少样品在流动相中的不溶物沉淀在柱子中。（13）日常使用后，可用强溶剂冲洗色谱柱。例如：ODS 柱每天使用完后，可用乙腈冲洗色谱柱，以除去柱子中强吸收的样品。2.3.4 农药标准曲线的制作配制标准溶液的浓度分别为 50mg/L 100 mg/L ，200 mg/L ，250 mg/L ，500 mg/L,在规定的
8、色谱条件下,待仪器稳定后 ,进样分析。制作农药浓度-峰面积标准曲线。2.3.5 色谱条件（1）流动相： 乙腈-水（75-25）（2）检测波长：290nm（3）进样量：20L（4）流速：1.0mL/min2.4 结果分析2 .4.1 农药的液相色谱图图表 1 水样：分析结果 编号 RT分钟 面积mV*s 类型 宽秒 面积%1 4.4000 4.1151 BB 11.0000 6.87022 6.7333 55.7829 BB 27.0000 93.1298图表 2 添加回收实验分析结果 编号 RT分钟 面积mV*s 类型 宽秒 面积%1 4.4500 4.5633 BB 11.0000 0.05
9、322 6.7500 9.3365 BB 16.0000 0.10883 7.8667 8569.1067 BB 177.0000 99.8381分析结果 编号 RT分钟 面积mV*s 类型 宽秒 面积%1 8.1333 28.9131 BB 34.0000 100.00002.4.2 农药标准曲线浓度（mg/L） 50 100 200 250 500峰面积（mV*s） 756.5584 1723.4883 3611.21394803.4736 3843.2743y = 0.05x + 13.838R = 0.9980501001502002503000 1000 2000 3000 4000
10、 5000 6000峰面积（mV*s）浓度（mg/L）毒死蜱农药标准曲线从前四组的数据来看，总体趋势是：随着毒死蜱浓度的增加，相应浓度对映的峰面积是增加的，而从第四组数据到第五组数据，随着毒死蜱浓度的增加，相应浓度对映的峰面积是减少的，显然第五组数据存在问题，所以在做标准曲线时将其舍去。2.4.2 添加回收率将 10000mg/L 的毒死蜱溶液分别稀释成 2mg/L、20mg/L 、200 mg/L，在上述色谱条件下进行检测，结果如下：峰面积（mV*s）浓度（mg/L）1 2 3 平均2 48.2824 58.9300 22.6450 43.285820 102.2389 10.7336（舍）
11、 28.9131 65.8234200 67.1340 19.2047 55.7829 61.4585添加回收率=测得的浓度/实际的浓度（1）对于浓度为 2mg/L 的添加回收率：测得的浓度=0.0543.2858+13.838=16.00（mg/L ）实际的浓度为 20mg/L所以：添加回收率=16.00/2100%=800%（2）对于浓度为 20 mg/L 的添加回收率：测得的浓度=0.0565.8234+13.838=17.13（mg/L ）实际的浓度为 20 mg/L所以：添加回收率=17.13/20100%=85.65%（3）对于浓度为 200 mg/L 的添加回收率：测得的浓度=0
12、.0561.4585+13.838=16.91（mg/L ）实际的浓度为 200 mg/L所以：添加回收率=16.91/200100%=8.46%（mg/L ）（4）分析：由上面得到的数据可以看出，浓度为 2mg/L 的添加回收率非常高，浓度为 20mg/L 的添加回收率非常低，不在合理范围 80%120%，而200mg/L 的添加回收率在 80%120%的合理范围之内。可能由于在萃取时没有萃取干净，或者在蒸发浓缩是出现误差如未把润洗完的浓缩液收集！导致本组的添加回收实验的浓度不在农药标准曲线范围之内。2.4.3 样品中农药浓度检测结果样品中含毒死蜱浓度为=0.0593.1298+13.838
13、=18.50（mg/L）3 实训小结与心得这是本次实训的第一门实验，早早的便来到了实验室进门就闻到一股乙酸乙脂的味道！廖老师为我们详细的讲解了本次实验的主要内容，及实验步骤，以及实验中的一些问题！本次实训的主要内容是农药残留分析与检测，具体内容包括样品前处理、添加回收实验和农药标准曲线以及高效液相色谱检测这四个方面，所使用的样品为含未知浓度的毒死蜱水样。首先是前处理操作，包括水样的提取和水样的浓缩。提取时，将水样和乙酸乙酯混于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，收集酯相，水相再加乙酸乙酯萃取两次。萃取完后，往酯相中加入适量的无水硫酸钠至无水硫酸钠不溶解或无结块产生。浓缩时，收集提取液，将提取液置于
14、 6070的水浴旋转蒸发器中。浓缩完后取 23mL 浓缩液用乙酸乙酯定容。其次是添加回收实验。具体的操作是：往 20mL 水中分别加入20L、200L、2000L 的 10000 mg/L 的毒死蜱溶液，吸取 2mL 与分页漏斗中，接下来操作同水样强处理相同。本小组只做 2L 的添加回收实验。再者是农药标准曲线的配制。配制 50mg/L、100 mg/L、200 mg/L、250 mg/L 和 500 mg/L 的毒死蜱标准溶液，在高效液相色谱上检测获得色谱图，从色谱图中得到相应浓度下的峰面积，作浓度-峰面积曲线即为农药标准曲线。最后是高效液相色谱的检测。HPLC 主要包括溶剂传输系统（泵） 、进样器、色谱柱、检测器和流动相五个组成部分，检测时，色谱条件如下：（1）流动相：乙腈-水（75-25） ；（2）检测波长：290nm；（3）进样量： 20L；（4）流速：10mL/min。水样在上诉色谱条件下进行检测，获得色谱图。在今天的实验中高效液相色谱的检测发生了些许的小插曲，导致了我们做到很晚。但通过本次实训，我们也了解到了对农药残留进行检测与分析的目的！它对食物安全的重要性！
