1、临床微生物检验与临床,临床微生物科 李 浩,微生物检验的重要性,在医学高度发展，新的抗菌药物不断涌现的今天，感染性疾病的发病率和病死率仍然居高不下。主要原因之一是当代的感染性疾病，在病原上发生了较大的变化，形成了现代感染性疾病在病原学上的新特点,现代感染性疾病的新特点,以条件致病菌为主：很多低致病、弱毒的细菌，在外环境、人体体表以及与外界相通的腔道中广泛存在的细菌，引起感染甚至造成严重后果的现象日益增多。病原菌的种类更为广泛：包括需氧菌、厌氧菌、苛氧菌、分枝杆菌和真菌等。,细菌的耐药性不断增强：同一种细菌对抗生素的耐药性可以完全不同，甚至出现同时耐多种抗生素的“多重耐药”细菌，往往使临床医师的
2、“经验性”治疗或所谓的常规治疗根本无效。,现代感染性疾病的新特点,提高感染样本送检率加强细菌耐药监测关注细菌性疾病的病原学诊断，已成为临床工作者、临床微生物与微生态工作者、药学家和从事感染控制的工作者共同关注的热门焦点。,病原微生物送检 是感染控制的基础,成功治疗感染症的因素 成功分离病原菌标本收集、运送、保存标本处理方法检验医师专业知识 医师判读病原菌培养结果 选择适当治疗方法,临床医生要合理用好两种数据,1. 本地区、本单位病原流行病学资料，指导经验用药。（微生物室、院感科、临床科室） 2.药敏试验报告，纠正经验用药。重视病原学检查,尽可能在应用抗菌药物之前留取标本送检。以提高病原学诊断率
3、,为选药和调整药物提供依据。,“正确的微生物学检验始自正确的标本采取。临床医师、护师及检验技师都必须通晓其要领。”著名的临床微生物检验专著Manual of Clinical Microbiology 的主编Patrick Murray,标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的关键 但由于标本的采集和运送常由护士或医生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处，造成的后果是: 临床医生最不能接受的问题:阳性率低,国内微生物标本的采集目前存在的问题 ： 标本送检率低 从全国来看，抗感染治疗前，送检相关标本可能只占应送标本的一半左右，与抗菌药物应用率之高形成鲜明的反差。一些
4、医师在经验性治疗受挫后方送标本，此时已失去阳性培养的机会。标本有缺陷 正确收集各种临床标本，关注特检标本采样与送检的方法和条件，是完成病原学诊断的先决条件。,微生物让人类步步为营，我们应该追求：“准确的病原学诊断”“针对性病原学治疗”正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提！,基本原则,1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.采样后立即送检 5.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂 6.送检标本应注明来源和检验目的,常见不合格标本主要有以下问题：,标本采集时间错误 容器错误 标本量不足标本采集延误标本未及时正确运送以及暂存条
5、件错误。,最有价值的细菌学检测项目,血液培养脑脊液培养胆汁培养胸腹水培养关节液其他无菌体液或分泌液,血培养标本,采集与运送,血培养是进行血流感诊断的最佳手段,目前血培养的问题：,采血时机不合适 采血套数不够 采血量不足 只做需氧培养，不同时做厌氧培养 采血前或采血时正在使用抗生素治疗,相似规模医院的血培养数, 国内多数三甲综合医院210 瓶/天 复旦大学中山医院2050瓶/天 香港玛丽医院200瓶/天 台湾大学医院300瓶/天 我院约1015瓶/天,1370瓶/2011年7月26日 美国，亚特兰大，埃默里大学附属一院，1100床位,平均100 人次/天 美国，亚特兰大，埃默里大学附属二院，90
6、0床位,实验室类型: 美国私立大医院微生物实验室 医院病床数: 800 beds 微生物标本量: 600个标本/天 血培养标本量: 150 瓶/天 血培养标准采样: 3套瓶/24小时 (1个需氧瓶+1个厌氧瓶=1套) 阳性结果: 10-30株需氧或兼性厌氧菌/天, 2株厌氧菌/月 BacT/ALERT 3D 240 7台,“只有在发热时，才需要进行血培养。”,关于血培养指征,想采就采,？,答 案：血培养的指征,当怀疑血流感染或脓毒症时，应常规行血培养 怀疑患者有血流感染的症状有： 不明原因的发烧(38)或体温过低(36) 白细胞增多（ 10,000/ul），粒细胞减少（ 1,000ul） 休克
7、，寒颤，僵直 严重的局部感染(脑膜炎，心内膜炎，肺炎，肾盂肾炎，腹部术后感染，) 心率异常加快 低血压或高血压 呼吸频率加快,“何时采血进行血培养，无特殊时间要求。”,关于采血时机,？,你认为对吗？ 为了提高病人血培养的阳性率，最好的抽血时间是：,A.发热开始时 B.寒战开始时 C.发热最高峰时 D.寒战结束时 E.预计寒战发热前,0,30,60,时间 (分钟),体温,血培养采血时机,细菌浓度,答 案：采集血培养样本的最佳时间,尽可能在患者寒战或开始发热时采血 在患者接受抗生素治疗前采血 如患者已经应用抗菌药物进行治疗，应在下一次用药之前采血培养,“为减轻患者痛苦，只从一个穿刺部位采一份血液标
8、本即可。”,关于采血套数及部位,？,基本概念,成人“一套” 血培养应该包括需氧瓶和厌氧瓶各一个，也叫“一份” 注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套应从另一个穿刺点获得。 儿童一般只做需氧培养，但仍需从多个部位采集多次。特殊患者才考虑厌氧培养。,采血套数,Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How Many BloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546-3548,表皮葡萄球菌的临床意义,23套血培养，有助于污染的判断。,Tokars
9、, JI. Clin Infect Dis 2004; 39:333,污染菌,致病菌,？,采集1套无法判断是病原菌还是污染菌。,答 案 ：关于血培养套数与采血部位,每位患者每次采血最少2套，3套更好 初发患者，绝不能只采1套标本多个穿刺部位采血。因多部位同时发生污染的几率较小，便于对结果进判断,“两套血培养采集间隔无特殊要求。”, 关于采血间隔,？,答案：关于标本采集间隔时间,对于非持续性菌血症，同时或短时间内采集23套血培养，因为体内巨噬细胞吞噬系统会在1530min内清除掉进入人体内的细菌。 可疑急性心内膜炎患者要立即取血作血培养，30分钟内完成3套血培养的采集，采集后立即进行抗菌药的经验
10、治疗。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。 可疑的亚急性心内膜炎患者每间隔30分钟至1h采集1套，连续采集3套标本。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。,“每瓶采集多少血液无特殊要求。”, 关于采血量,？,菌血症病人血中细菌浓度 成年病人: 链球菌心内膜炎 1 to 30 organisms/ml 葡萄球菌心内膜炎 1 to 20 organisms/ml 革兰氏阴性菌血症 少于1 to 10 organisms/ml 革兰氏阳性菌血症 1 to 300 organisms/ml幼儿病人: 革兰氏阴性菌血症 5 to 1000 organisms/ml 75%幼儿菌血症病人
11、血液有100 organisms/ml 所以采血量一定要足够！,采血量(ml)与检出率的关系,Overall,血培养物每增加一毫升，真性菌血症 成年人微生物的检出率增加3,但并非越多越好，超过一定数量的采血量会稀释培养瓶内的肉汤，使肉汤无法有效中和血中的抑制物质（补体、抗体、抗生素）。所以血液与肉汤的最佳比例为1：41：10,答 案：关于采集血液量,采血量是影响灵敏度最关键因素 成人一份标本2个培养瓶（需氧厌氧），每瓶810ml，共20ml；要求至少采两份标本，即40ml。 儿童一般只需采集需氧瓶，在保证采集血量1总血量下，一般为13ml 采血量不足时应优先保证需氧瓶，因临床90以上的感染为需
12、氧菌或兼性需氧菌感染,先采生化、凝血标本，再采血培养标本。”,关于各种血液标本的采集顺序,？,血培养对无菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它标本要高。 所以要最先采集血培养标本。 污染率的指标是 3%（100份标本里只能有不到3个标本出现污染。）,答案：采各种血液标本的先后顺序,“消毒的重点是足够量的消毒剂。”,关于皮肤及培养瓶消毒,？,皮肤消毒程序：,推荐使用碘町、洗必泰或碘伏作为皮肤消毒剂。碘町作用1min碘伏作用1.5-2min洗必泰作用时间与碘町一样（但不能用于少于2个月婴儿皮肤消毒）,培养瓶的消毒程序：,去掉培养瓶口的塑料瓶盖。 75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞子60秒。 自然待干。
13、 将标本注入培养瓶内。 5. 颠倒混匀标本与肉汤，以避免血液凝集。,“培养瓶未使用时，需要冷藏或冷冻。”,关于培养瓶的储存温度,？,不需冷藏，更不能冷冻。保存在1525的室温即可，温度过低会导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。,答案：关于未用培养瓶的储存温度,“加入标本后的培养瓶夜班未能及时送到检验科，可以冷藏或放入35的温箱。”,关于夜班血培养的送检,？,培养瓶夜班未能及时送到检验科，存在室温即可，不能冷藏也不能放入35 的温箱 。过夜不会对检测造成影响，但仍需尽快送检。冷藏可能导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。温箱会导致细菌进入生长对数期，从而错过检测的最佳时期。,答案：关于夜班血培养的送检,“
14、患者静脉中插有导管，可直接从导管采血。”,关于采血部位,？,不可以，常规血培养不宜从静脉导管或静脉留置装置中采集，检出污染或定植菌的可能性较大。除非怀疑导管相关性血流感染，请参照导管相关性血流感染的采血方法。,答案：关于从静脉留置装置直接采血,有临床意义的分离株 Bourbeau PP et al. Routine incubation of BacT/ALERT FA and FN blood culture bottles for more than 3 days may not be necessary. J Clin Microbiol. 2005; 43:2506-2509,结果表明
15、培养的前三天，有临床意义分离株的97%被检出，培养前两天的检出率为94%。,97,痰培养标本,采集与运送,病原体种类繁多而复杂,使下呼吸道感染病原诊断成为难题,细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌） 真菌（包括肺孢子菌） 病毒 支原体、衣原体与立克次体 原虫 寄生虫,咳痰途经口咽部,唾液中口咽部定植菌的浓度可达108-109/ml。 研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。,不可避免地受到污染,我国痰细菌培养现状,标本送检率低 苛养菌检出率极低 结果重复性差 报告速度慢 感染菌与污染菌不易区分 药敏结果与治疗反应存在差距,咳痰标本的采集,标本采集方法 医师或护士直视下采集标
16、本 病人先漱口，去除表面的菌群 教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液临床上约半数咳痰标本不合格！,关于咳痰标本,在抗生素应用前采集痰标本; 标本采集后12h内必须立即进行实验室处理 咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本 取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口 深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导 无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰 也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰,几种下呼吸道直接采集的标本,经气管穿刺吸引（transtracheal aspiration,TTA） 经胸壁针刺吸引（transthoracic needle aspiration, TN
17、A） 经支气管镜采样 支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL） 经支气管镜直接吸引 防污染样本毛刷（protective specimen brush, PSB） 开胸肺活检（open-lung biopsy，OLB） 经人工气道吸引分泌物（endotracheal aspirates，ETA）,痰培养的送检次数,对于普通细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续23天。不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变；怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检；,标本质量,脓痰,粘液样痰,唾液or诱导痰 (?),带血痰,用革兰氏染色来评估 呼吸道标本是否合格,呼
18、吸道标本的涂片评估模式,尿培养标本,采集与运送,尿培养标本,清洁中段尿 导尿导管尿 经耻骨上皮肤穿刺采集膀胱内尿液 送检标本以晨起第一次尿液为佳 不能立即送检者，可暂存4冰箱，但保存不超过8h,清洁中段尿液,尽量取早晨第一次尿液 弃去开始流出的尿液，以冲刷尿道口的细菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿 详细告知病人以下操作步骤 女性病人 收集标本前用清洗液冲洗干净，从前向后仔细擦洗尿道区域 分开阴唇，开始排尿 排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 回缩包皮并清洗龟头 排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿,导尿管尿液,集尿袋内的尿液不能用作培养； 导尿管末端的尿液也不能用于培养，因为很难
19、避免没有尿道菌群污染。 留置导管尿液标本常通过专门的采样端口采集，不能把导尿管与尿袋拔开后收集尿液。 采样端口用酒精消毒；必要时，可先夹住导尿管但不能超过30分钟；将注射器针头插入采样端口，抽吸出尿液；注入无菌杯或试管中,耻骨上穿刺吸取尿液,常用于患儿、泌尿道厌氧菌感染或脊柱损伤病人等。 可避免尿道或会阴细菌的污染，但对膀胱内少量尿液的小儿难以实施。 可用于厌氧菌检测,出现如下情况时，怎样判断？,化脓和创伤标本采集,组织或器官的化脓性感染，其病原菌的来源可分为两类： 内源性：感染源是炎症局部周围器官中的正常菌群，由于损伤等因素进入无菌状态的组织内，发生感染。 外源性：感染源是存在于人体外部自然
20、界的微生物，由于外伤和直接接触通过人体表面进入人体，造成感染。脓液的细菌学检查对于确定感染的种类（结核性或非结核性等）、提供药物敏感结果和指导临床治疗有重要的意义。,（一）标本采集 1开放性感染和已溃破的化脓灶 标本采集前先用灭菌生理盐水拭去表面渗出物，尽可能用抽吸或将拭子深入伤口，紧贴伤口前沿取样，从脓肿底部或脓肿壁取样，效果最好。慢性感染，污染严重，很难分离到致病菌，可取感染部位下的组织，研磨成组织匀浆接种于适宜的培养基。 2封闭性脓肿 局部消毒后用针及注射器抽吸脓肿壁，将所有物质置于无菌试管内送检，疑为厌氧菌感染时立即作床边接种或置于厌氧转运装置送检（针头插一橡皮塞隔绝空气）。但取样时，
21、可能会带入与感染过程无关的定植细菌。 3大面积创伤感染：可取感染组织块或沾有脓汁的内层敷料送检。,（二）注意事项 细菌对干燥敏感或只能采集少量标本时，用棉拭子采集标本后立即放入液体培养基内，或采标本前先将棉拭子沾少许肉汤以保持标本湿度。 对于不能立即送检的标本，应放4保存，培养淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的标本除外。 尽可能在用药前采集标本。 采样前病灶局部应避免用抗菌药物或消毒剂。 革兰染色对标本进行评估。涂片中如出现上皮细胞提示标本已被污染。没有上皮细胞而有白细胞说明标本采集正确。 有的创伤均可有细菌污染，但不一定发生感染，因此对分离到的细菌要根据创伤的情况、菌量和种数，收集标本的处理过程、机
22、体免疫力及抗生素的使用情况等多种因素来分析判断。,与临床沟通中常见问题,1、我们想用的药物在药敏试验中 没有做？ 可能是天然耐药 可能是药物的敏感性被其他药物所预报,与临床沟通中常见问题,2.为什么有的菌报告很多种药物， 有的仅报告几种药物？ 报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多，而肠球菌报告的药敏较少,与临床沟通中常见问题,3、是否能将所用的药都做药敏试验? 没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性 没有可能：不是所用药物都可以做药敏试验（需要药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准）,与临床沟通中常见问题,4.明显稀便，培养结果为何
23、正常？ 大便普通培养，通常只能鉴定志贺菌、沙门菌感染，致病性大肠杆菌我们没有鉴定血清。 怀疑霍乱时，需开霍乱弧菌培养。 可能病毒感染(轮状病毒)。,与临床沟通中常见问题,5、培养阳性的细菌都需要用抗菌药物治疗吗？ 不是的 培养阳性感染，可能为污染（血培养），可能为定植（痰培养） 任何结果必须结合临床情况进行评价（很重要） 感染部位的清创、引流、换药比使用抗菌药物更加重要 改善患者全身情况：器官功能支持，纠正酸碱平衡，电解质紊乱，低蛋白血症，高血糖等,与临床沟通中常见问题,6、选择药敏报告敏感的药物，为什么临床治疗无效？体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同； 一般来说，耐药治疗无效； 敏感
24、治疗有效。 可能不是真正的致病菌（污染或定植菌） 细菌本身因素（如诱导耐药，生物被膜） 感染部位与药代动力学因素 给药剂量和用药方式 药敏试验药物中有些药物单独使用无效，但可以与其他药物联合用药 药物剂型及生物利用度（纯品、商品）,与临床沟通中常见问题,7、涂片镜检结果与培养结果不吻合？ 涂片镜检是报告所有检见的细菌，而培养的目的是检出致病菌。 一些苛氧菌需在特殊的环境或培养基上才能生长。,与临床沟通中常见问题,8、取的明显就是脓液标本，为何鉴定报告为无菌生长？ 我们做的是有氧培养，脓液可能为厌氧菌感染。 可能细菌被大量的中性粒细胞吞噬。,与临床沟通中常见问题,9、今天的培养结果怎么与前天的不一样？ 取材是否规范。 痰标本，有时选优势菌做，就可能导致两次不一样。,与临床沟通中常见问题,10、一般培养不是三天出结果吗，今天第四天了怎么还没出来？ 一般培养经48小时后，即第三天出报告，若需分离苛养菌的则第四天出报告。,谢谢!,
