农杆菌介导的木薯转基因研究初报.pdf

1、第 27 卷 第 3 期Vol127 , No13 广 西 农 业 生 物 科 学Journal of Guangxi Agric1and Biol1 Science 2008 年 9 月Sept1 , 2008收 稿 日 期 : 2007211223 ; 修 回 日 期 : 2007212203。基 金 项 目 : 广 西 科 学 研 究 与 技 术 开 发 计 划 (桂 科 基 0009017) 。作 者 简 介 : 覃 艳 (19792) , 女 (壮 族 ) , 广 西 南 宁 人 , 硕 士 , 现 在 广 西 玉 林 市 玉 州 区 农 业 局 工 作 ;E2mail : qiny

2、an222 1631com。通 讯 作 者 : 何 勇 强 , 教 授 , 博 士 生 导 师 ; E2mail : yqhe gxu1edu1cn。文 章 编 号 : 100823464 (2008) 0320218205农 杆 菌 介 导 的 木 薯 转 基 因 研 究 初 报覃 艳 1 , 何 勇 强 2 , 农 友 业 1 , 姜 伯 乐 2 , 吴 子 恺 1(1 广 西 大 学 农 学 院 , 广 西 南 宁 530005 ; 2 广 西 大 学 生 命 科 学 与 技 术 学 院 , 广 西 南 宁 530005)摘 要 : 将 米 曲 霉 植 酸 酶 基 因 phyA 克 隆

3、于 植 物 表 达 载 体 pBI121 的 CaMV35S 启 动 子 ( P35S) 下 游 , 构建 了 含 有 P35S2phyA2TNOS表 达 盒 的 重 组 质 粒 pBI2phyA , 并 用 电 脉 冲 法 将 其 导 入 大 肠 杆 菌 中 。 通 过 三 亲 接 合将 pBI2phyA 质 粒 由 大 肠 杆 菌 导 入 根 癌 农 杆 菌 LBA4404 菌 株 , 获 得 带 有 p hyA 基 因 的 根 癌 农 杆 菌 工 程 菌 株LBA4404/ pBI2phyA。 用 LBA4404/ pBI2phyA 转 化 木 薯 外 植 体 652 个 , 在 含 1

4、00 mg/ L 卡 那 霉 素 和 250 mg/ L氨 苄 青 霉 素 的 MS 分 化 培 养 基 上 诱 导 分 化 芽 , 获 得 24 株 抗 卡 那 霉 素 转 化 苗 。 以 转 化 苗 和 未 转 化 植 株 的 总DNA 为 模 板 , 用 phyA 基 因 的 同 源 序 列 为 引 物 , 进 行 聚 合 酶 链 式 反 应 ( PCR) , 结 果 表 明 9 株 转 化 苗 的PCR 结 果 为 阳 性 , 初 步 证 明 目 的 基 因 phyA 已 经 转 入 木 薯 中 。关 键 词 : 植 酸 酶 基 因 ; 根 癌 农 杆 菌 ; 木 薯 ; 转 基 因中

5、 图 分 类 号 : Q94312 文 献 标 识 码 : APreliminary report on genetic transformation of cassavamediated by Agrobacterium t ume f aciensQ IN Yan1 , H E Yong2qiang2 , NON G You2ye1 , J IAN G Bo2le2 , WU Zi2kai1(1 College of Agriculture , Guangxi University , Nanning 530005 , China ;2 College of Life Science an

6、d Technology , Guangxi University , Nanning 530005 , China)Abstract : The A s pergill us ory z ae p hytase gene p hy A was cloned into the site of downstream t heCaMV35S promoter ( P35S) of t he plant expression vector pBI121 , generating a recombinant plasmidpBI2p hyA containing t he expression cas

7、sette P35S2p hyA2TNOS1 pBI2p hyA was then introduced into t heEscherichi a coli cells by electroporation1 The genetic engineering A g robacteri um t umef aciens strainLBA4404/ pBI2p hyA was constructed by introducing t he plasmid pBI2p hyA LBA4404 fromE1 coli/ pBI2p hyA via triparental conjugation1

8、652 explant s of cassava ( M ani hot esculenta Crantz) wereco2cult ured wit h LBA4404/ pBI2p hyA1 Regenerated shoot s were selected out on MS mediumsupplemented with 100 mg/ L kanamycin and 250 mg/ L ampicilin1 24 p utative transgenic plant s wereobtained1 The total genomic DNAs of t hese regenerate

9、d plant s and untransformed plant s weredetected wit h polymerase chain reaction ( PCR) 1 The result indicated that 9 of t hese regeneratedplant s contained p hy A gene1Key words : p hytase gene ; A g robacteri um t umef aciens ; cassava ; genetic transformation木 薯 ( M ani hot esculenta Crantz) 是 热

10、带 地 区 重 要 的 粮 食 作 物 之 一 , 在 我 国 主 要 分 布 于 广 西 、 广东 、 海 南 、 云 南 等 南 方 省 区 1 。 木 薯 用 途 广 泛 , 其 产 业 链 长 , 经 济 效 益 高 , 开 发 前 景 好 , 已 经 成 为 与国 计 民 生 息 息 相 关 的 重 要 资 源 。 我 国 已 将 木 薯 作 为 发 展 生 物 质 能 产 业 的 重 要 原 料 之 一 , 木 薯 科 技 已 成为 我 国 科 技 发 展 的 重 点 领 域 2 。 木 薯 遗 传 改 良 备 受 关 注 , 特 别 是 在 提 高 其 块 根 产 量 、 块 根

11、 淀 粉 含 量 、淀 粉 改 性 、 降 低 氰 化 物 含 量 及 提 高 抗 病 、 抗 逆 能 力 等 方 面 , 瑞 士 联 邦 理 工 大 学 植 物 研 究 所 、 哥 伦 比 亚的 国 际 热 带 农 业 研 究 中 心 (CIA T) 和 尼 日 利 亚 的 国 际 热 带 农 业 研 究 所 ( IITA) 等 研 究 机 构 做 了 大 量的 基 础 研 究 工 作 328 。 近 年 来 , 中 国 科 学 院 华 南 植 物 研 究 所 、 上 海 生 命 科 学 研 究 院 植 物 生 理 生 态 研 究所 均 相 继 建 立 了 木 薯 转 化 系 统 7 ,9

12、, 为 我 国 木 薯 遗 传 改 良 奠 定 了 基 础 。广 西 是 我 国 木 薯 生 产 的 第 一 大 省 区 , 2005 年 以 来 , 其 种 植 面 积 和 年 产 量 均 保 持 在 全 国 的 75 %左右 。 木 薯 产 业 在 广 西 已 成 为 一 个 规 模 大 、 产 业 面 广 、 地 方 特 色 明 显 的 优 势 产 业 10 。 然 而 , 在 木 薯 种质 改 良 方 面 , 广 西 起 步 较 晚 , 缺 少 木 薯 遗 传 改 良 的 经 验 和 转 基 因 的 高 效 方 法 。 本 研 究 利 用 农 杆 菌 介导 , 将 米 曲 霉 植 酸

13、酶 基 因 导 入 木 薯 中 , 获 得 了 木 薯 转 基 因 植 株 , 为 在 分 子 水 平 上 改 良 广 西 主 栽 木 薯 品种 提 供 了 第 一 手 的 试 验 数 据 。1 材 料 与 方 法111 材 料11111 植 物 材 料 木 薯 ( M ani hot esculent a Crantz) 栽 培 种 辐 选 01 , 由 广 西 大 学 木 薯 课 题 组 以 华 南124 为 材 料 , 经 辐 射 诱 变 育 成 。11112 细 菌 菌 株 与 质 粒 所 用 菌 株 是 根 癌 农 杆 菌 LBA440411 , 质 粒 pBI121 是 一 个 双

14、 元 表 达 载 体 ,具 有 T2DNA 整 合 的 必 需 序 列 , 以 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 的 neo 为 选 择 标 记 基 因 , 从 多 克 隆 位 点 插 入 的 外源 基 因 由 CaMV35S 启 动 子 ( P35S) 控 制 , 终 止 子 为 胭 脂 碱 终 止 子 TNOS 12 。11113 目 的 基 因 及 其 特 异 引 物 植 酸 酶 基 因 ( phyA) 由 农 友 业 博 士 克 隆 自 米 曲 霉 ACCC3015 菌 株 13 。 用于 扩 增 植 酸 酶 基 因 的 PCR 特 异 引 物 由 上 海 鼎 安 生 物 公 司 合 成

15、 , 序 列 分 别 为 PF ( 5 2GGGTCTAGAATGGCA GTCCCCGCCTCGA G23 ) 和 PR (5 2CCCCCCGGGCTAAGCGAAACACTCCCCCC23 ) , PCR产 物 全 长 1 365 bp。11114 试 剂 及 抗 生 素 Taq DNA 聚 合 酶 、 乙 酰 丁 香 酮 (AS) 、 利 福 平 ( Rif) 、 卡 那 霉 素 ( Km) 、 氨苄 青 霉 素 (Amp) 、 CTAB (十 六 烷 基 三 乙 基 溴 化 铵 ) 等 分 子 生 物 学 试 剂 购 自 上 海 生 物 工 程 公 司 ; 其他 生 化 试 剂 和

16、常 规 试 剂 均 为 超 纯 或 分 析 纯 。11115 培 养 基 木 薯 无 菌 苗 培 养 采 用 MS 培 养 基 14 ; 预 培 养 培 养 基 为 含 1 mg/ L 2 ,42D 和 015 mg/ L62BA 的 MS ; 共 培 养 培 养 基 同 预 培 养 培 养 基 ; 抑 菌 培 养 基 为 含 250 mg/ L Amp 的 共 培 养 培 养 基 ; 分化 培 养 基 为 含 有 210 mg/ L 62BA、 0105 mg/ L NAA 和 10 mg/ L AgNO3的 MS15 ; 筛 选 分 化 培 养 基 为分 化 培 养 基 中 加 250 m

17、g/ L Amp 和 100 mg/ L Km ; 生 根 培 养 基 为 含 有 011 mg/ L NAA16 、 250 mg/ LAmp 和 100 mg/ L Km 的 MS。 以 上 培 养 基 中 均 含 3 %蔗 糖 , 用 017 %琼 脂 固 化 。 农 杆 菌 培 养 基 用YEB 培 养 基 17 , YEB 固 体 培 养 基 含 琼 脂 15 g/ L 。112 实 验 方 法11211 农 杆 菌 介 导 木 薯 转 基 因 方 法 将 p hy A 克 隆 于 植 物 表 达 载 体 pBI121 , 用 电 脉 冲 方 法 , 将 pBI2p hyA 质 粒

18、导 入 大 肠 杆 菌 。 通 过 三 亲 接 合 将 pBI2p hyA 质 粒 由 大 肠 杆 菌 导 入 根 癌 农 杆 菌 LBA4404 菌株 。 农 杆 菌 LBA4404/ pBI2p hyA 工 程 菌 株 于 加 有 25 g/ mL Rif 和 1215 g/ mL Km 的 YEB 培 养 基 中28 摇 床 培 养 , 活 化 过 夜 的 农 杆 菌 按 1 50 的 比 例 接 种 在 相 同 的 YEB 液 体 培 养 基 中 , 继 续 培 养 至 对数 生 长 期 。 收 集 菌 体 , 再 用 1/ 2 MS 液 体 培 养 基 (加 100 mol/ L 乙

19、 酰 丁 香 酮 ) 悬 浮 至 OD600 = 015。将 木 薯 无 菌 苗 从 腋 芽 处 (未 长 出 侧 芽 ) 切 除 生 长 点 , 使 腋 芽 处 的 分 生 组 织 切 开 形 成 伤 口 , 在 预 培 养 培养 基 上 培 养 2 d。 取 待 转 化 的 木 薯 外 植 体 放 入 含 农 杆 菌 的 MS 液 体 培 养 基 中 , 摇 动 15 min , 取 出 并 用无 菌 滤 纸 吸 去 多 余 的 菌 液 , 置 共 培 养 培 养 基 的 培 养 皿 中 光 照 培 养 。 培 养 条 件 为 : 温 度 26 , 光 照2 000 lx ,每 天 光 照

20、 14 h。 共 培 养 3 d 后 转 接 入 抑 菌 培 养 基 中 , 继 续 在 光 照 培 养 箱 培 养 4 d , 培 养 条 件同 上 。 将 木 薯 外 植 体 从 抑 菌 培 养 基 中 转 接 到 筛 选 分 化 培 养 基 , 每 周 继 代 一 次 培 养 , 培 养 条 件 同 上 。 直到 新 生 芽 长 出 。 待 新 生 芽 长 到 1 2 cm 时 , 将 其 从 外 植 体 剥 离 , 植 入 生 根 培 养 基 , 每 两 周 继 代 一 次 。912第 3 期 覃 艳 等 : 农 杆 菌 介 导 的 木 薯 转 基 因 研 究 初 报将 抗 性 小 苗

21、 移 于 玻 璃 瓶 中 以 1/ 2 MS 培 养 基 培 养 , 当 其 生 长 到 10 15 cm 时 将 瓶 盖 打 开 , 以 使 植 株 逐渐 适 应 外 界 环 境 , 开 放 培 养 2 d 后 再 将 植 株 慢 慢 地 拔 出 , 洗 净 根 部 所 带 琼 脂 , 移 栽 到 土 壤 中 , 保 持 土壤 湿 度 , 温 度 约 28 。11212 分 子 鉴 定 取 2 g 木 薯 幼 嫩 叶 片 置 于 研 钵 中 并 加 入 液 氮 研 磨 成 粉 末 , 将 粉 末 装 入 50 mL 的 离心 管 中 ; 在 离 心 管 中 加 入 8 mL 65 预 热 的

22、 CTAB 抽 取 液 , 上 下 缓 慢 混 匀 , 于 65 水 浴 锅 中 温 育30 60 min , 使 植 物 总 DNA 与 CTAB 充 分 结 合 ; 65 水 浴 30 60 min 后 , 加 入 等 体 积 的 24 1 的氯 仿 异 戊 醇 抽 提 , 上 下 缓 慢 混 匀 至 25 , 10 000 r/ min 离 心 10 min , 转 移 上 清 液 于 另 一 50 mL 离 心管 ; 加 入 十 分 之 一 体 积 的 65 预 热 的 CTAB 溶 液 , 混 匀 ; 加 入 等 体 积 的 CTAB 沉 淀 液 , 混 匀 , 如 出现 沉 淀 则

23、 做 下 一 步 , 如 无 沉 淀 则 在 65 温 育 30 min ; 10 000 r/ min 离 心 10 min ; 弃 上 清 , 用 高 盐 TE缓 冲 液 重 悬 沉 淀 ; 用 016 倍 体 积 的 异 丙 醇 沉 淀 , - 20 放 置 20 min , 于 4 、 10 000 r/ min 离 心10 min , 弃 上 清 液 ; 用 75 %的 乙 醇 洗 涤 沉 淀 2 次 , 干 燥 , 用 TE 缓 冲 液 溶 解 沉 淀 17 。 以 木 薯 总 DNA做 模 板 , 用 p hy A 基 因 引 物 进 行 PCR 扩 增 。 反 应 体 系 为

24、: 模 板 DNA 10 ng (约 1 L ) , 10 PCRbuffer 5 L , dN TP 215 L (终 浓 度 75 mol/ L ) , 引 物 PF 和 PR 各 215 L (终 浓 度 均 为015 mol/ L) , Taq 酶 015 U , 加 dd H2 O 补 至 50 L 。 该 反 应 体 系 于 PCR 仪 中 进 行 , 程 序 为 :95 3 min ; 95 1 min , 60 45 s , 72 1 min , 30 个 循 环 ; 72 下 延 伸 10 min。 反 应 结 束 后 取 扩增 产 物 10 L , 与 2 L 6 上 样

25、缓 冲 液 ( 0125 %溴 酚 兰 , 40 %蔗 糖 ) 混 匀 , 110 %琼 脂 糖 凝 胶 于015 TB E缓 冲 液 , 以 0321 Marker 为 分 子 量 参 照 , 在 5 V/ cm 电 场 强 度 下 电 泳 约 1 h , EB 染 胶 后 用紫 外 凝 胶 成 像 系 统 观 察 和 照 相 17 ,18 。2 结 果 与 分 析211 带 有 phyA 基 因 植 物 表 达 载 体 导 入 根 癌 农 杆 菌植 酸 酶 基 因 ( p hy A) 编 码 区 (CDS) 全 长 1 347 bp , 编 码 1 条 含 448 个 氨 基 酸 残 基

26、的 蛋 白 质 。 将米 曲 霉 植 酸 酶 基 因 p hy A 克 隆 于 植 物 表 达 载 体 pBI121 的 CaMV35S 启 动 子 ( P35S) 下 游 , 构 建 了 含 有P35S2p hyA2TNOS表 达 盒 的 重 组 质 粒 pBI2p hyA (图 1) 。 用 电 脉 冲 方 法 , 将 pBI2p hyA 质 粒 导 入 大 肠 杆菌 , 再 通 过 三 亲 接 合 将 pBI2p hyA 质 粒 由 大 肠 杆 菌 导 入 根 癌 农 杆 菌 LBA4404 菌 株 , 获 得 带 有 p hy A基 因 的 根 癌 农 杆 菌 工 程 菌 株 LB44

27、04/ pBI2p hyA。图 1 植 物 表 达 载 体 pBI2phyA的 结 构Fig11 Structure of pBI2phyA plant expression vector212 农 杆 菌 介 导 的 木 薯 转 化 系 统 的 选 择 压 力 和 抑 菌 条 件为 确 定 卡 那 霉 素 选 择 压 力 , 在 分 化 培 养 基 中 分 别 加 入 0、 25、 50、 75、 100、 125、 150、200 mg/ L Km , 分 别 置 入 已 诱 导 出 愈 伤 组 织 的 木 薯 外 植 体 50 个 进 行 培 养 。 3 周 后 观 察 外 植 体 及

28、愈 伤组 织 生 长 状 况 , 结 果 发 现 , Km 浓 度 在 125 mg/ L 以 上 的 处 理 , 木 薯 外 植 体 全 部 黄 化 , 愈 伤 组 织 生 长停 滞 ; Km 浓 度 在 50 mg/ L 以 下 的 处 理 , 大 部 分 外 植 体 未 变 黄 , 且 能 分 化 出 芽 点 ; 75 mg/ L Km 的 处理 , 有 27 个 外 植 体 局 部 变 黄 ; 100 mg/ L Km 的 处 理 , 有 39 个 外 植 体 变 黄 。 结 果 表 明 , Km 选 择 压 力为 100 mg/ L对 木 薯 比 较 合 适 。本 研 究 选 用 氨

29、 苄 青 霉 素 对 根 癌 农 杆 菌 进 行 抑 制 。 将 共 培 养 后 的 植 外 体 用 无 菌 水 冲 洗 , 并 用 无 菌 滤纸 吸 去 多 余 的 水 分 后 置 于 分 别 加 入 0、 100、 150、 200、 250、 300 mg/ L Amp 的 分 化 培 养 基 中 培 养 。结 果 表 明 , 以 250 mg/ L Amp 每 周 转 皿 一 次 , 可 完 全 抑 制 农 杆 菌 LBA4404 的 生 长 。213 转 化 植 株 的 再 生外 植 体 经 过 带 有 目 的 基 因 的 根 癌 农 杆 菌 侵 染 、 共 培 养 后 , 经 过

30、6 7 周 的 筛 选 分 化 培 养 , 非 转 化的 木 薯 细 胞 已 得 到 充 分 的 抑 制 , 有 些 不 能 承 受 Km 筛 选 剂 的 作 用 而 慢 慢 死 亡 , 而 部 分 外 植 体 横 断 面022 广 西 农 业 生 物 科 学 第 27 卷处 开 始 长 出 绿 芽 (图 22A) 。 在 新 一 轮 继 代 转 皿 时 , 将 带 有 绿 色 芽 点 的 外 植 体 选 出 , 继 续 在 筛 选 分 化培 养 基 上 培 养 , 2 周 后 即 开 始 陆 续 长 成 小 芽 苗 (图 22B) 。 待 新 生 芽 长 到 1 2 cm 时 , 将 其 从

31、 外 植 体 剥离 , 植 入 生 根 培 养 基 , 每 两 周 继 代 一 次 。 发 根 后 将 抗 性 小 苗 移 于 玻 璃 瓶 中 以 1/ 2 MS 培 养 基 培 养 (图22C) , 当 其 生 长 到 10 15 cm , 将 瓶 盖 打 开 , 以 使 植 株 逐 渐 适 应 外 界 环 境 , 开 放 培 养 2 d 后 再 将 植 株慢 慢 地 拔 出 , 洗 净 根 部 所 带 琼 脂 , 移 栽 到 土 壤 中 (图 22D) 。 652 个 外 植 体 经 过 侵 染 、 共 培 养 、 筛 选 、再 生 , 最 终 共 获 得 24 株 对 Km 有 抗 性

32、的 植 株 , 再 生 率 为 3168 %。图 2 农 杆 菌 介 导 木 薯 转 基 因 示 意 图Fig12 A sketch of Agrobacterium2mediated gene transformation of cassavaA1 筛 选 分 化 培 养 基 上 的 木 薯 外 植 体 ; B1 木 薯 外 植 体 长 出 芽 苗 ; C1 木 薯 再 生 苗 发 根 ; D1 转 基 因 木 薯 苗A1 The explants on selective and regenerative medium ; B1 The bud seedlings regenerated

33、from explants ; C1 Cassavaroots regenerated from kanamycin resistant explants ; D1 Transgenic cassava plant214 转 化 植 株 的 PCR检 测用 CTAB 法 从 转 化 木 薯 植 株 中 抽 提 总 DNA , 用 p hy A 基 因 引 物 对 DNA 进 行 PCR 扩 增 。 24 个 抗Km 的 转 化 株 中 有 9 个 经 PCR 检 测 为 阳 性 , 能 成 功 扩 增 到 预 计 的 p hy A 基 因 的 特 异 带 (约 1 300 bp) ,而 非 转

34、 化 对 照 植 株 不 能 扩 增 出 条 带 (图 3) , 表 明 p hy A 基 因 已 转 入 木 薯 中 。 本 试 验 采 用 的 农 杆 菌 介导 木 薯 转 化 系 统 的 转 化 率 为 3101 %。图 3 转 phyA基 因 的 木 薯 植 株 的 PCR鉴 定Fig13 Identif ication of phyA gene transgenic cassava by using PCRM1 0321 标 准 DNA ; 1 111 有 Km 抗 性 的 植 株 ; 121 以 pBI1212phyA 质 粒 为 模 板 ; 131 以 未 经 过 转 化 的 木

35、 薯 植 株总 DNA 为 模 板M1 0321 Marker ; 1 111 Km resistant cassava plants ; 121 pBI2phyA plasmid used as template ; 131 Total DNA ofuntransformed cassava plant as template3 结 论 与 讨 论本 研 究 利 用 含 质 粒 pBI2p hyA 的 根 癌 农 杆 菌 LBA4404 菌 株 对 木 薯 幼 茎 腋 芽 分 生 组 织 进 行 外 源 基因 转 化 , 在 含 100 mg/ L 卡 那 霉 素 和 250 mg/ L 氨

36、 苄 青 霉 素 的 MS 分 化 培 养 基 上 诱 导 分 化 芽 , 获 得 了24 株 Km 抗 性 苗 , PCR 结 果 表 明 9 株 转 化 苗 带 有 目 的 基 因 。以 往 实 验 表 明 , 农 杆 菌 对 木 薯 的 亲 和 性 不 高 4 ,9 。 本 研 究 发 现 , 较 嫩 的 材 料 作 外 植 体 易 被 根 癌 农杆 菌 侵 染 , 而 较 老 的 分 生 细 胞 可 能 因 其 生 理 、 生 化 上 的 某 种 变 化 导 致 与 农 杆 菌 不 亲 和 。 采 用 木 薯 幼 茎腋 芽 作 外 植 体 , 利 用 了 分 生 组 织 能 活 跃 地

37、 产 生 内 源 激 素 控 制 器 官 发 生 的 特 点 , 经 过 农 杆 菌 的 侵 染 , 其122第 3 期 覃 艳 等 : 农 杆 菌 介 导 的 木 薯 转 基 因 研 究 初 报伤 口 处 就 会 形 成 瘤 状 物 , 当 其 积 累 大 量 的 营 养 与 激 素 后 就 能 重 新 分 化 成 芽 , 这 种 方 法 诱 导 再 生 的 效 率较 高 。 外 植 体 接 种 农 杆 菌 后 在 筛 选 培 养 基 上 培 养 时 , 必 须 合 理 掌 握 接 菌 的 数 量 和 共 培 养 时 间 , 注 意 解决 细 菌 增 殖 所 导 致 的 外 植 体 不 能

38、生 长 的 矛 盾 。 采 用 预 培 养 等 手 段 可 减 轻 伤 害 胁 迫 , 调 整 细 胞 状 态 , 调节 激 素 水 平 以 利 于 农 杆 菌 的 感 染 9 ,18 ,19 。 采 用 化 学 缓 解 剂 (如 硝 酸 银 具 有 促 进 形 态 发 生 和 抑 制 乙 烯 产生 的 功 能 ) 缓 解 胁 迫 对 外 植 体 生 长 的 抑 制 9 ,18 。 不 同 植 物 或 同 一 植 物 的 不 同 基 因 型 、 外 植 体 类 型 对 农杆 菌 的 敏 感 性 不 同 , 因 此 转 化 效 率 也 有 明 显 差 异 9 ,18 ,19 。 本 研 究 以

39、木 薯 幼 茎 腋 芽 作 为 外 植 体 的 转 化 率为 3101 % , 比 其 他 研 究 者 以 子 叶 为 外 植 体 的 4179 %转 化 率 低 4 。 下 一 步 我 们 将 针 对 幼 茎 腋 芽 遗 传 转化 率 , 从 基 因 型 、 共 培 养 时 间 、 培 养 基 及 筛 选 剂 等 方 面 进 行 优 化 , 以 期 提 高 遗 传 转 化 率 。本 研 究 成 功 地 利 用 幼 茎 腋 芽 为 外 植 体 诱 导 出 木 薯 植 株 , 该 方 法 具 有 外 植 体 易 得 、 诱 导 周 期 短 、 激素 用 量 相 对 较 少 4 ,9 、 操 作

40、方 便 等 优 点 。 本 研 究 获 得 的 一 系 列 用 于 木 薯 遗 传 转 化 的 培 养 基 、 筛 选 条 件等 为 木 薯 品 种 的 分 子 育 种 奠 定 了 基 础 。植 酸 及 其 盐 类 是 植 物 组 织 中 磷 的 主 要 贮 存 形 式 , 其 含 量 高 达 1 % 3 % , 是 一 种 非 常 丰 富 的 有 机磷 源 20 。 本 研 究 获 得 的 转 p hyA 基 因 的 木 薯 植 株 , 将 作 为 研 究 材 料 在 研 究 外 源 植 酸 酶 的 基 因 功 能 、提 高 动 物 对 植 物 饲 料 中 磷 素 的 利 用 率 、 降 低

41、 饲 料 成 本 及 减 少 环 境 污 染 等 方 面 发 挥 作 用 。参 考 文 献 :1 姚 庆 荣 , 郭 运 玲 , 郭 安 平 , 等 1 木 薯 基 因 工 程 育 种 研 究 现 状 与 展 望 J . 安 徽 农 业 科 学 , 2007 , 35 (6) :1636216371 2 戴 杜 , 理 河 , 浦 耿 强 , 等 1 广 西 木 薯 燃 料 乙 醇 项 目 能 效 评 估 J . 广 西 农 业 生 物 科 学 , 2005 , 24 (2) : 167217113 A ERN I P1 Mobilizing science and technology fo

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