1、 桑椹酒渣中花青素提取1 材料与方法1.1 材料桑椹果酒酒渣。1.2 试剂药品试验所用 95%乙醇、浓盐酸、 30%过氧化氢、Na 2SO3 等试剂均为分析纯。1.3 主要仪器电子分析天平、分光光度计、旋转蒸发仪、酸度计、高速冷冻离心机、电热恒温水浴锅等。1.4 方法（稀 HCl+95%乙醇提取）样品称量，用提取剂提取，过滤（减压过滤/板框过滤） ，所得的提取液按一定比例稀释（pH1.0氯化钾缓冲液和pH4.5醋酸钠缓冲液稀）释后在分光光度计上测出 OD值，以OD值代表桑椹红色素的含量。1.4.1 不同溶剂的吸光光谱及提取效果比较分别以 75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、0.05% 稀 HC
2、l+95%乙醇（1：1） 、0.10%稀HCl +95%乙醇（ 1：1）作为提取剂，以物料与提取剂之比 1：10 提取桑椹色素，提取液经3 倍稀释后用分光光度计测定各提取液吸收光谱。1.4.2 不同物料与提取剂之比对花青素提取的影响（此时用提取效果最好的提取剂） 。1.4.3 温度对提取效果的影响以最佳结果作为桑椹提取剂，分别于 60、50、40、30、20下提取 1h。1.4.4 提取时间对提取效果的影响每隔 20 分钟取样测得 OD 值。1.4.5 正交实验1.4.6 得率试验称取一定量样品，经提取后。提取液经旋转蒸发仪蒸发，真空干燥，求得率。方法一稀 HCl+95%乙醇提取1 不同溶剂的
3、吸光光谱及提取效果比较固定浸提温度、提取时间、液料比，分别85%乙醇、95%乙醇、0.05%稀HCl+95%乙醇（1：1） 、0.10%稀HCl +95%乙醇（1：1） 、0.15%稀HCl +95%乙醇（1：1）为提取剂进行浸提试验，色素提取液分别采用pH1.0氯化钾缓冲液和 pH4.5醋酸钠缓冲液稀释一定倍数 (吸光值在0.20.8之间)，将稀释液静置15min，分别测定两种样品稀释液OD max和700nm处的吸光值A。按公式计算桑椹花色苷含量，分析提取溶剂对花色苷提取量的影响。注：OD max 的确定分别以85%乙醇、95% 乙醇、0.05%稀HCl+95%乙醇（1：1） 、0.10%
4、稀HCl +95%乙醇（ 1：1） 、0.15%稀HCl +95%乙醇（1：1）作为提取剂，以物料与提取剂之比1：10提取桑椹色素，提取液经3倍稀释后用分光光度计测定各提取液吸收光谱。2不同物料与提取剂之比对花青素提取的影响（此时用提取效果最好的提取剂） 。分别称取2.0g酒渣，按液料比5、10、15、20、25、30加入相应体积的浸提溶剂，在40下避光提取2h后，抽滤、离心(3000rpm，10min)。取1mL清液，用pH 1.0和pH 4.5的缓冲溶液稀释(吸光值在0.20.8 之间) ，分别测定两种样品稀释液在 ODmax和700nm 处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对液料比作图
5、，分析液料比对色素提取量的影响。3温度对提取效果的影响分别称取2.0g酒渣置入5个50mL的三角瓶中，各加入浸提溶剂，搅拌5 min ，用封口膜将瓶口密封并用铝箔纸包裹好以避光。分别置于30、40、50、60 、70的恒温水浴上提取2h后，抽滤、离心(3000rpm，10min)。取1mL 上清液，用 pH 1.0和pH 4.5的缓冲液稀释(吸光值在0.20.8之间)，分别测定两种样品稀释液在OD max和700nm 处的吸光值A ，按公式计算花色苷含量，并对温度作图，分析温度对色素提取量的影响。4 提取时间对提取效果的影响每隔30分钟取样测得OD值。用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液稀释(
6、吸光值在0.20.8之间) ，分别测定两种样品稀释液在OD max和700nm 处处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对时间作图，分析提取时间对色素提取量的影响。5桑椹红色素酸性乙醇溶剂提取条件的正交试验根据单因素试验的结果，选取L 9(34)正交试验表，以浸提溶剂中乙醇浓度、浸提时间、浸提温度、液料比为因素，安排4水平做正交试验，以确定提取的最佳条件。方法二超声波辅助提取桑椹红色素1超声波功率对红色素提取的影响精确称取2.0g桑椹酒渣若干份，按液料比？分别加入？提取液，在30温度下，分别以200700 W 超声功率萃取20min。抽滤、离心得到色素粗提液，用 pH1.0和pH4.5缓冲液稀
7、释( 吸光值控制在0.20.8之间 )，分别测定两种样品稀释液在 ODmax和700nm 处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对超声功率作图，分析功率对色素提取量的影响。2超声温度对色素提取量的影响精确称取2.0g桑椹酒渣若干份，按液料比？分别加入？提取液，以？W超声功率分别在2060温度下萃取 20min。抽滤、离心得到色素粗提液，用 pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释(吸光值在 0.20.8之间)，分别测定两种样品稀释液在OD max和700nm 姗处的吸光值A ，按公式计算花色苷含量，并对超声温度作图，分析温度对色素提取量的影响。3超声时间对色素提取量的影响精确称取2.0g桑椹酒渣若干
8、份，按液料比？分别加入？提取液，在？温度下，以？W超声功率分别萃取5、10、15、20、25、30min。抽滤、离心得到色素粗提液，用 pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释(吸光值在0.20.8之间)，分别测定两种样品稀释液在OD max和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对超声时间作图，分析时间对色素提取量的影响。4桑椹红色素超声波辅助提取条件的正交试验根据单因素试验的结果，选取L 9(34)正交试验表，以超声功率、超声温度、超声时间为因素，安排3水平做正交试验，以确定提取的最佳条件。方法三微波辅助提取桑椹红色选择微波辅助提取温度30、40 、50、60、70 , 以微波功率50
9、0W、600W、700W 、800W、900W,微波辐射时间2S、 4S、6S、8S、10S以及液料比10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 为单因素考察因素.选择其中重要的 3 因素进行正交实验。最后 HPLC 分析：将三种方法所得到的产品进行 HPLC 分析，看其活性物质是否有变化，主要是后面两种方法是否对活性物质改变。方法三超高压辅助提取桑椹红色1 压力对色素提取量的影响精确称取2.0g桑椹酒渣若干份放入超高压处理袋内，按液料比？分别加入？提取液，封口包装；以不同压力100500MPa进行加压3min，加压 1次的处理。抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲溶液
10、稀释(吸光值在0.20.8之间)，分别测定两种样品稀释液在OD max和700nm处的吸光值 A，按公式计算花色苷含量，并对高压压力作图，分析压力对色素提取量的影响。2 加压时间对色素提取量的影响精确称取2.0g桑椹酒渣若干份放入超高压处理袋内，按液料比？分别加入？提取液，封口包装；分别以加压时间l 5min进行300MPa，加压1次的高压处理。抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释(吸光值在0.20.8之间)，分别测定两种样品稀释液在OD max和700nm处的吸光值 A，按公式计算花色苷含量，并对加压时间作图，分析时间对色素提取量的影响。3加压方式间歇式对色素提取量
11、的影响精确称取2.0g桑椹酒渣若干份放入超高压处理袋内，按液料比？分别加入？提取液，封口包装；分别加压1次(300MPa 处理3min) 、加压2次(300MPa处理1.5min，卸压，再300MPa处理1.5min) 、加压3 次(300MPa处理1min，卸压，再 300MPa处理1min ，再300MPa处理1min) 。 抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释( 吸光值在0.20.8之间)，分别测定两种样品稀释液在 ODmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对加压次数作图，分析结果。方法四加入酶对红色素提取的影响未加酶；果胶酶0.1%；纤维素酶
12、 .01%；果胶酶0.05%+纤维素酶0.05%。测定花色苷含量的方法有很多，经典的有薄层层析法、快速测定比色法、紫外吸收光谱(UV)等，现代的有红外吸收光谱、液相色谱(HPLC)以及核磁共振(NMR) 、质谱(FAB)等。除紫外吸收分光光度法外，其余方法均需要标准色素样品，测定的是某种花色营的具体含量。这对于尚未确定组成的新样品的初步研究是一个难题，也给一般性的检验分析带来了困难。花色苷是水溶性色素，根据比尔定律，溶液的浓度与其吸光度 A 成正比，因此在未有标准品时，可用紫外-可见吸收分光光度法测定总花色苷的含量。花色苷含量主要有 2 种表示方法：色价及代入消光系数用公式计算。由此可见，关键
13、是吸光值 A 的测定。综合国内外资料，主要有以下几种计算吸光值 A 的方法：(1)当叶绿素是该样品中主要存在的干扰色素时，需消除叶绿素吸收含量的影响；此时，计算公式为：A=(AmaxA 620) 0.1(A 650A 620)国内已有用此方法测定苹果果皮表面及山植果实中花色苷含量的报道。(2)含有其它干扰物质时花色苷总量的测定:直接法：在新鲜的植物提取物中，因为很少含有在花色营的最大吸收区发生吸收的干扰物质，花色苷总量可以直接由可见区最大吸收波长处的吸光度来测定。计算公式为：A=AmaxpH 示差法：在食品加工或储藏过程中，会产生褐色降解物，这些降解物和花色普具有相同的能量吸收范围。这类花色苷
14、总量的测定，通常用 pH 示差法。计算公式为：A=(AmaxA 700)pH1.0(A max A700)pH4.5本研究通过两种分光光度方法测定桑堪果汁中花色昔的含量，运用数学统计分析，比较得出了适合于桑椹中花色苷测定的简便、准确的方法，从而为其他样品花色苷含量的测定提供了一般性思路。本实验样品采用的是桑椹果酒酒渣进行试验，故只需采用 pH 示差法来测定总花色苷含量。在食品加工或贮藏过程中，会产生褐色降解物，这些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范围，这类花色苷总量的测定，通常采用pH 示差法，计算公式为：A=(AmaxA 700)pH1.0(A max A700)pH4.5测定方法：将色素提
15、取液，分别采用pH1.0 氯化钾缓冲液和pH4.5 醋酸钠缓冲液稀释一定倍数( 吸光值在0.20.8之间 )，并且将稀释液静置15min，达到动态平衡后，分别测定两种样品稀释液在OD max和700nm 处的吸光值A。参考植物生理学实验指及冯建光pH 示差法测定葡萄皮红色素含量的方法，以及结合霍琳琳等采用分光光度法测定桑椹花色苷含量，得到提取液中总花色苷含量的计算公式： mMnVgTAcy)/(式中：V一提取液总体积(mL)；n一稀释倍数；MCy-3-glu的分子量(449 2)；一Cy-3-glu的消光系数，其值为26900；m 一原料的重重(g)红色素稳定性研究1 pH 值对色素颜色的影响
16、用柠檬酸、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠调色素溶液的 pH 值为 2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、8.5，室温下用色差计观察溶液颜色变化，分析 pH 值对色素颜色的影响。2 热对色素稳定性的影响取 pH 为？的色素稀释液 100mL 于 30、40、60、80、90、100的恒温水浴中加热，隔一定时间，测定色素溶液在 ODmax处的吸光度值，分析热对色素稳定性的影响。3 光对色素稳定性的影响取 pH 值为？的色素稀释液 100mL 分别置于直射光、室内散射光下，隔一定时间测定色素溶液在 ODmax处的吸光度值，分析光对色素稳定性的影响。4 糖对色素稳定性的影响配制 pH 为？的含有不同
17、浓度的葡萄糖、蔗糖的色素稀释液，隔一定时间，测定色素溶液在 ODmax处的吸光度值，分析糖对色素稳定性的影响。5 防腐剂对色素稳定性的影响配制含有不同浓度的苯甲酸钠和山梨酸钾的 pH 为？的色素稀释液，隔一定时间，测定色素溶液在 ODmax下的吸光度值，分析防腐剂对色素稳定性的影响。6 氧化剂和还原剂对色素稳定性的影响配制含有不同浓度的亚硫酸钠和过氧化氢的 pH 为？的色素稀释液，隔一定时间，测定色素溶液在 ODmax处的吸光度值，分析亚硫酸钠和过氧化氢对色素稳定性的影响。7 金属离子对色素稳定性的影响配制含有不同浓度的K+、Ca 2 、Na 、Mg 2 、Cu 2 、Zn 2 、Fe 3 、Mn 2 、Ba 2 、Sn 2+、Al 3+的 pH 为？的色素稀释液，隔一定时间，观察颜色变化，测定色素溶液在 ODmax处的最大吸光值，分析不同浓度的金属离子对色素稳定性的影响。桑椹红色素抗菌性研究1 分析桑椹红色素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的抑制作用。2 分析桑椹红色素对各种细菌的抑制作用研究注：还可以考虑怎样把桑椹红色素提纯。
