1、万家启航教育 2018 春季班 高二生物 828287561微生物的利用知识点归纳补充1 微生物的实验培养1. 培养基：概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。成分：一般都含有碳源、氮源、水和无机盐，还需要满足不同微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求。类型：物理性质划分：固体（含琼脂等凝固剂）-用于微生物的分离，鉴定，计数，菌种保存液体：扩大培养，工业生产等半固体：观察细菌的运动，厌氧菌的分离等按用途划分：基础培养基：是含有一般微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基（LB)是最常用的基础培养基.选择培养基：是在普通培养基中加入特殊营
2、养物质或化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。鉴别培养基：是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物注意：有些营养物质既可做为 C 源，也可以作为 N 源，如牛肉膏，蛋白胨等；异养型微生物需要有机 C 源或 N 源，有机 C 源或 N 源可作为其能源；可以通过改变培养基的成分来筛选除某些特定的微生物。2.无菌技术方 法消 毒 煮 沸 消 毒 法化 学 药 剂 消 毒 法紫 外 线 消 毒 法 )灭 菌 灼 烧 灭 菌干 热 灭 菌高 压 蒸 汽 灭 菌 )消毒和灭菌的区别项目
3、条件 结果 常用的方法万家启航教育 2018 春季班 高二生物 828287562消毒 较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌几种消毒和灭菌方法及其适用范围类型 适用范围 操作方法煮沸消毒法 日常生活 100 煮沸 56 min巴氏消毒法 不耐高温的液体 7075 煮 30 min 或 80 煮 15 min化学药剂 生物活体、水源等 擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源消毒方法紫外线 房间、仪器设备
4、 紫外线照射 30 min灼烧 接种工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱，160170 加热 12 h灭菌方法高压蒸汽灭菌 培养基、培养皿等，生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内，(1Kg/cm2)100 kPa，121 ，1530 min2. 培养基的配制：牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备：计算称量溶化灭菌倒平板。配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项倒平板的适宜温度是 60左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，
5、造成污染。调 PH 应在灭菌之前试管斜面制备：直接将未凝固的含琼脂的培养基加入试管，灭菌后讲试管斜放，令其冷却，即成斜面尿素固体培养基的制备;注意：培养基：(500g/cm 2)90以上，30 min 灭菌；尿素溶液：G6 玻璃漏斗过滤灭菌3.细菌的分离方法：划线分离法和涂布分离法万家启航教育 2018 春季班 高二生物 828287563(1)划线分离法方法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，使聚集的菌种分散到培养基的表面。每个菌落就是一个细菌产生的后代。应用：用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨
6、苄青霉素基因)，如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌和其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到 107 10 5 倍，然后取 0.1 mL 稀释度不同的菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。（3）细菌的两种分离方法的比较项目 划线分离法 涂布分离法工具 接种环 玻璃刮刀原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落将
7、菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，但操作复杂目的 使培养基上形成单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体菌落划线分离操作的注意事项第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。划线时最后一区域不要与第一区域相连。涂布分离操作的注意事项4.微生物数量的统计方法常规的计数方法是涂布分离法和显微镜直接计数法。(1)涂布分离法 该法的基本原理是：将待测含菌样品
8、经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，然后取一定量的稀释样品液，接种到平板上。经过一定时间培养后，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的单菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个活菌。最后统计菌落数，根据其稀释倍数和取样量，换算出单位样品中所含的活菌数。万家启航教育 2018 春季班 高二生物 828287564实际上，由于待测样品不易完全分散成单个细胞，故所形成的菌落并非都是单菌落，有一部分是由两个或两个以上的细胞长成的，因此平板菌落计数的结果会比实际偏低。现在已采用菌落形成单位(cfu)来表示样品的活菌含量。用涂布分离法计数时，一般选择菌落数在 30300 的平板计数，同时做一系列浓度
9、梯度实验，探究合适的稀释度。对分解尿素的微生物计数时，一般制备成102 、10 3 、10 4 、10 5 土壤稀释液。注意：若进行分离纯化微生物，则选择每个培养皿中有 20 个以内的单菌落最为合适。(2)显微镜直接计数法测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数的方法，该法操作方法是取酵母菌或霉菌孢子悬液，滴加在血细胞计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下直接进行计数，是一种常用的微生物计数方法。5.分离以尿素为氮源的微生物的注意事项：(1)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶分解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活
10、性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。(2)与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少部分。(3)本实验中配制固体培养基时应选用琼脂糖而不能选用琼脂作凝固剂。这是由于琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。(4)由于尿素在高温下会分解，所以对尿素溶液的灭菌要采用 G6 玻璃漏斗过滤的方法。并且应在基本培养基经高压蒸汽灭菌后，冷却至 60 时再加入。(5)土样应
11、从有哺乳动物排泄物的地方取得，这是由于动物排泄物中有一定量的尿素，在这些土壤中一般含有较多的分解尿素的细菌。6大肠杆菌的培养和分离(1)大肠杆菌特点：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。(2)细菌的繁殖：以二分裂的方式繁殖，分裂速度很快。(3)细菌的扩大培养：用 LB 液体培养基，划线分离用 LB 固体平面培养基。(4)大肠杆菌的分离操作技术最常用方法是划线分离法，其操作步骤是：培养基灭菌：将刚配制好的 50 mL LB 液体培养基和 50 mL LB 固体培养基分别装入万家启航教育 2018 春季班 高二生物 828287565两个 250 mL 的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。倒平板
12、：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在 4 个培养皿中，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的液体培养基中，三角瓶在 37 ，每分钟 200 转的摇床中振荡培养 12 h。划线分离：将摇床上培养 12 h 的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在 37 恒温培养箱中进行培养，1224 h 后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已经分离。菌种保存：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在 37 下培养 24 h 后，置于 4 冰箱中保存。7.分离以尿素为氮源的微生物（1）菌种特点含有
13、脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源，其反应式为：CO(NH 2)2H 2O 2NH3CO 2。 脲 酶 （2）培养基用以尿素为唯一氮源的培养基培养，用 LB 全营养培养基作为对照。（3）实验原理筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行选择培养。细菌合成的脲酶能将尿素分解成 NH3，致使培养基 pH 升高，使酚红指示剂变红。（4）实验步骤制备培养基：将已灭菌的 LB 固体培养基和尿素固体培养基分别倒入两个培养皿中，摇匀，平放至凝固。制备细菌悬液：用 1 g 土样配制不同浓度的细菌悬液。用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入有 LB 培养基和尿素培养基的培
14、养皿中，并用玻璃刮刀涂布到整个平面上。培养：将培养皿倒置，在 37 恒温箱中培养 2448 h。观察：观察培养基中菌落的数量。（5）反应的鉴定在配制培养基时，加入指示剂酚红，培养时细菌将尿素分解，产生碱性的氨，使培养基上菌落周围出现红色的环带。万家启航教育 2018 春季班 高二生物 8282875668.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用对照组 作用 现象 结论未接种培养基 有无杂菌污染的判断未接种的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染接种的牛肉膏蛋白胨培养基选择培养基筛选作用的确认牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用9.培养基中观测指标的分析(1)培养基中的酚红指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。(2)与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少部分。
