1、T-DNA 插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti 质粒是上有一段特殊的 DNA 区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该 DNA 区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体 DNA 中。所以 Ti 质粒上的这一段能转移的 DNA 被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到 T-DNA 区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。通过本实验，我们将学习如何用 PCR 的方法检测所得植株是否为 T-DNA 的插入突变体。1.引言T-DNA 作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。如果 T
2、-DNA 插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌 Ti 质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌 Ti 质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有 T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。本次实验中，采用液 CTAB（或者 TSP 法）提取拟南芥植株的 DNA，然后 PCR 将所获DNA 扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的 DNA 带，以确定样品是否为 T-DNA 插入突变纯和体。PCR（Polymerase Chai
3、n Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR 基本原理如右图）DNA 含有 PO43-基团，在 pH8.0 Buffer（本实验中为 TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的 DNA 片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对 Ma
4、rker 电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状 DNA 分子分离范围不同。（如下图）2.实验材料试验材料待检测拟南芥植株，我们组选的是 18 号拟南芥苗；实验试剂液氮，CTAB 提取液，氯仿/异戊醇（24:1），无水乙醇，70%的乙醇，TE；引物（Lp、Rp、Bp），反应缓冲液，dNTP，ddH2O，耐热聚合酶；琼脂糖，TAE 缓冲溶实验器材离心机，恒温槽，PCR 仪，电泳仪，电子天平，冰块；离心管（0.2ml、0.5ml），移液枪等必要的实验器材。3.实验步骤3.1 CTAB 法提取 DNA（1（ 用液氮 100mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于 1.5 ml 离心管中加入预热至
5、65的600 l 的 2CTAB 提取液，轻摇混匀。（2（ 65水浴 30min，其间轻摇混匀。（3（ 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀 10 min，12000 rpm 离心 15 min，再转移上清液入新管。（4（ 向上清液中加入 2 倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 下 30 min ，12000 rpm 离心 15 min，弃上清。（5（ 用 70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm 稍离心，弃上清。（6（ 将沉淀晾干，加 20-50 l TE (pH 8.0)， 65水浴 30 min 溶解 DNA。3.2 PCR 步骤：（1）配置反应体系：
6、主要包括 DNA 模板，引物，反应缓冲液，dNTP，ddH 2O，耐热聚合酶。（2）25ul 体系：ddH 2O 16ul，缓冲溶液 2.5ul，镁离子 2ul，dNTP 0.5ul，引物 1ul，DNA模板 2ul，taq 酶 0.2ul。20ul 体系：H2O 13ul，10xTaq buffer（含 MgCl2) 2ul，引物 LP (10 uM) 1ul，引物 RP (10 uM) 1ul，引物 BP (10 uM) 1ul，dNTP (各 2.5mM) 1ul，模板 DNA(30-50ng/l) 1ul， Taq 酶(5U/l ) 1ul。（3）配好体系，轻摇混匀，4000rpm 离
7、心 10 秒钟。（4）设定反应程序：1) 预变性：94，5min；2) 循环部分：变性解旋 94，40sec；退火 53，50sec；延伸 72，80sec，循环 35 次；3) 延伸部分：72，10min；4) 保存：4下可以保存 1-2 天。3.3 琼脂糖凝胶电泳（7（ 配置 40ml1.2%的琼脂糖凝胶：称取 0.489g 的琼脂糖放入锥型瓶中，加入 40ml TAE 加热使其溶解，注意不要使其暴沸；（8（ 将加热溶解的琼脂糖凝胶稍冷却，大约到 50，将所得溶液移入琼脂糖槽中，使之冷却成型；（9（ 将冷却凝固的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入 TAE 电极缓冲缓，直到液体稍浸没凝胶；（10（
8、 向所得的 25ul PC 体系中加入 5ul 6loading buffer，轻摇混匀；（11（ 以此向点样空中滴加样品，marker DNA 滴加约 5ul，其他的样品，每个点样空滴加 15ul（TSP 法提取样品由于量很少，只加了 10ul）；（12（ 点样完成后，加上 110v 电压，凝胶电泳大约 30-40 分钟，直到 DNA 大概跑到凝胶的三分之二处；（13（ 取出凝胶，放入 EB（溴化乙锭，强突变剂，剧毒慎碰）染液中染色 10-15 分钟；（14（ 之后放入凝胶成像仪中，观察 DNA 电泳的情况。4.结果 图一为 CTAB 法提取的一组 18 号拟南芥 DNA，其中号的引物为 L
9、P 和 RP，号管是BP 和 RP，号管是三引物 PCR 后电泳的结果；是使用 TSP 法提取的一组 18 号拟南芥 DNA，由于提取结果不好，这里就不多介绍了。号为 Marker DL2000。由上图所示，号泳道以 LP 和 RP 为引物 PCR 出的没有线性带；号泳道以 BP 和 RP为引物 PCR 出的只有一条 7501000bp 大的条带，目测约为 850bp；号泳道也有一条约为850bp 的线性带，但是 850bp 的带上面还有一条，看不清楚的带，约为 1100bp 大小。由此，我们组的实验结果不是很理想，不能判断 TiDNA 插入情况。所以，我们又做一次 PCR 和电泳，结果如下图
10、所示。1 2 3 4 5图二本次实验，我们采取了 20ul 系统，考虑到上次结果，我们的三引物 PCR 电泳结果多出了一条带，分析我们可能是插入的杂合突变体，这次对 LP 和 RP 为引物的电泳做了两个。来验证 LP、RP 组是否是真的没有大片段。如上图所示：1、5 号泳道是 marker DL2000，2、3、4 号泳道分别是以 LP、RP引物 PCR 电泳结果，以 BP、RP 引物 PCR 电泳结果，以 LP、RP 引物 PCR 电泳的结果。可以看出，只有三引物的 PCR 电泳出来的结果有一条大片段。5.分析：DL2000 Marker 电泳分析中各条带分布情况（如左图）：5.1 结果分析
11、各插入类型理论组合插入类型 野生型 杂合突变型 纯和突变型片段大小LP、RP： 大 大 无BP、RP： 小 中等 中等LP、RP、BP： 大、小 大、中等 中等如电泳图所示结果所示，本次实验是比较成功的。DNA Marker 的选取上也比较合适：各长度的 Marker 分布比较均匀，能比较精确的从 Marker 电泳条带之间读出电泳结果；从DNA 电泳距离看，图一显示第一次电泳结果不是很好： 100bp 左右的非特异性带非常接近凝胶边缘快要跑出，但目标带所在位置在 Marker 条带之间 1/2 到 2/3 处，比较适合观察。根据图一、图二所示结果，以 2 个电泳道的 LP、RP 为引物的 P
12、CR 电泳结果没有大片段，只有 100bp 大小片段，因此可以排除图一中 3 引物 PCR 电泳出现的大片段结果，推断图一中泳道的大片段为 850bp 的大片段的拖尾，所以，我们组选的 18 号拟南芥是纯和突变体。5.2 实验分析5.2.1 加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。5.2.2 DNA 有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。5.2.3 加液氮碾磨时，注意不要将叶片挤到离心管的底部，那样会导致碾磨
13、不充分。5.2.4 在碾磨时，注意观察离心管内叶片的情况，直到叶片呈现翠绿色的粉末即表示碾磨充分。5.2.5 DNA 模板中蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制 PCR 反应；模板降解会导致 PCR 扩增无产物；模板加量过多也会导致非特异性扩增增加。引物的长度要适当、避免二级结构和二聚体；避免反复冻融；浓度适当,过高导致非特异性增加,过低则无扩增产物。Mg 2+浓度过高，非特异性增强，过低无扩增产物。5.2.6 PCR 中所需的各种试剂都应避免污染，而且尽量减少冻融的次数。5.2.7 电泳电压的确定一般是按照 5V/cm 来确定，此次实验中所有电泳槽长约 20cm，计算的电压为 100V，但是根据第一
14、次实验结果看，30min、100V 电压的电泳，DNA 跑胶距离不够，所以为了提高实验速度，在 DNA 承受范围内，将电压提高到 110V。5.2.8 再次强调 EB（溴乙锭）是一种荧光染料，能嵌入到双链核酸碱基对平面之间，250310 nm 波长的紫外光激发下发出橙红色光，常用于检测核酸分子。因此它也是一种强诱变剂，有致癌作用。染色时一定做好防护。6.拓展讨论：拟南芥作为高等植物研究的模式植物的理由：拟南芥命周期短，仅有一个月；这种杂草状的十字花科植物，在所有植物中基因组率先被完整破译.拟南芥只有五对染色体，基因组较小；基因操作方便。培养条件：气候室生长，温度 18-22C，空气湿度 70%-80%，光照强度 300mol/sm2 。参考文献1.山东大学遗传学实验 ppt2.T-DNA 插入突变及其研究进展/王凤华、李光远/河南科技大学
