1、 Proteomics Bio-Rad 蛋白质组双向电泳实验操作手册 ProteomeWorks TMSystem 1 2双向电泳实验流程 样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） PDQuest软件分析（Software analysis） 质谱鉴定（Protein identification）
2、3目 录 第一章 实验材料 11 IPG预制胶条及载体两性电解质 12 蛋白质定量试剂盒及其试剂 13 试剂盒及其试剂 14 化学试剂 15 蛋白质Marker 16 染色试剂 17 注意事项 第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 1 溶液的配制 2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制 2. 3 操作方法 2. 4 注意事项 第三章 双向电泳 3. 1 溶液配制 3. 2 操作步骤 3. 3 注意事项 附录 1 双向电泳完整的操作步骤 附录 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置 附录 3 细胞样品的一般处理步骤 附录 4 组织样品的一般处理步骤 4第一章 实验材料 11 IPG预制胶条及
3、载体两性电解质 （一）IPG预制胶条（美国 Bio-Rad公司） ，-20冰箱保存 IPG 预制胶条 pH 3-10， 7 cm 163-2000 IPG 预制胶条 pH 3-10， 7 cm ，nonlinear（NL） 163-2002 IPG 预制胶条 pH 4-7， 7 cm 163-2001 IPG 预制胶条 pH 3-6， 7 cm 163-2003 IPG 预制胶条 pH 5-8， 7 cm 163-2004 IPG 预制胶条 pH 7-10， 7 cm 163-2005 IPG 预制胶条 pH 3-10， 17cm 163-2007 IPG 预制胶条 pH 3-10， 17 c
4、m，nonlinear（NL） 163-2009 IPG 预制胶条 pH 4-7， 17cm 163-2008 IPG 预制胶条 pH 3-6， 17cm 163-2010 IPG 预制胶条 pH 5-8， 17cm 163-2011 IPG 预制胶条 pH 7-10， 17cm 163-2012 IPG 预制胶条 pH 3-10， 18cm 163-2032 IPG 预制胶条 pH 3-10， 18cm，nonlinear（NL） 163-2033 IPG 预制胶条 pH 4-7， 18cm 163-2034 IPG 预制胶条 pH 3-6， 18cm 163-2035 IPG 预制胶条 p
5、H 5-8， 18cm 163-2036 IPG 预制胶条 pH 7-10， 18cm 163-2037 IPG 预制胶条 pH 3-10， 11cm 163-2014 IPG 预制胶条 pH 3-10， 11cm，nonlinear（NL） 163-2016 IPG 预制胶条 pH 4-7， 11cm 163-2015 IPG 预制胶条 pH 3-6， 11cm 163-2017 IPG 预制胶条 pH 5-8， 11cm 163-2018 IPG 预制胶条 pH 7-10， 11cm 163-2019 IPG 预制胶条 pH 3.9-5.1，17cm 163-2020 IPG 预制胶条 p
6、H 4.7-5.9，17cm 163-2021 IPG 预制胶条 pH 5.5-6.7，17cm 163-2022 IPG 预制胶条 pH 6.3-8.3，17cm 163-2023 5 IPG 预制胶条 pH 3.9-5.1，18cm 163-2038 IPG 预制胶条 pH 4.7-5.9，18cm 163-2039 IPG 预制胶条 pH 5.5-6.7，18cm 163-2040 IPG 预制胶条 pH 6.3-8.3，18cm 163-2041 IPG 预制胶条 pH 3.9-5.1，11cm 163-2024 IPG 预制胶条 pH 4.7-5.9，11cm 163-2025 IP
7、G 预制胶条 pH 5.5-6.7，11cm 163-2026 IPG 预制胶条 pH 6.3-8.3，11cm 163-2027 IPG 预制胶条 pH 3.9-5.1，7cm 163-2028 IPG 预制胶条 pH 4.7-5.9，7cm 163-2029 IPG 预制胶条 pH 5.5-6.7，7cm 163-2030 IPG 预制胶条 pH 6.3-8.3，7cm 163-2031 （二）载体两性电解质（美国 Bio-Rad公司） ，4冰箱保存 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，10ml 163-1112 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，
8、25ml 163-1113 Bio-Lyte 3/5 Ampholyte，20%，10ml 163-1132 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，10ml 163-1142 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，25ml 163-1143 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，10ml 163-1152 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，25ml 163-1153 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1162 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1163
9、 Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml 163-1172 Bio-Lyte 8/10 Ampholyte，20%，10ml 163-1182 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1192 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1193 （三）等电聚焦上样缓冲液（美国 Bio-Rad公司） ，4冰箱保存 100ReadyStrip Buffer，for pH 7-10 IPG Strips，1ml 163-2093 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，100，1ml 163-2094 10
10、0ReadyStrip Buffer，for pH 6.8-8.3 IPG Strips，1ml 163-2095 100ReadyStrip Buffer，for pH 5.5-6.7 IPG Strips，1ml 163-2096 100ReadyStrip Buffer，for pH 4.7-5.9 IPG Strips，1ml 163-2097 6 100ReadyStrip Buffer，for pH 3.5-5.1 IPG Strips，1ml 163-2098 12 蛋白质定量试剂盒及其试剂 Protein Assay Kit I，bovine -globulin standar
11、d 500-0001 Protein Assay Kit II，BSA standard 500-0002 Protein Standard I，bovine -globulin，1 bottle 500-0005 Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450ml 500-0006 Protein Standard II，bovine serum albumin，1 bottle 500-0007 RC DC Protein Assay Kit I，bovine -globulin standard 500-0121 RC DC Protein Assay
12、 Kit II，BSA standard 500-0122 13 试剂盒及其试剂 ReadyPrep Sequential Extraction Kit 163-2100 Tributylphosphine（TBP） ，200mM，0.6ml 163-2101 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1，1vial 163-2102 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2，1vial 163-2103 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3，1
13、vial 163-2104 ReadyPrep 2-D Starter Kit 163-2105 ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106 ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I，with DTT 163-2107 ReadyPrep Starter Kit Equilibration BufferII 163-2108 Iodoacetamide，30g 163-2109 E.coli Protein Sample，lyophilized，2.7mg 163-21
14、10 ReadyPrep Overlay Agarose，50ml 163-2111 14 化学试剂 尿素 Urea，2 5 0 g 1 6 1 - 0 7 3 0 尿素 Urea，1 k g 1 6 1 - 0 7 3 1 AG 501-X8（D）Mixed Bed Resin 142-6425 CHAPS，1g 161-0460 CHAPSO，1 g 1 6 1 - 0 4 6 5 Triton X-100，500ml 161-0407 DTT（Dithiothreitol） ，1g 161-0610 DTT（Dithiothreitol） ，5 g 1 6 1 - 0 6 1 1 7 T
15、ributylphosphine（TBP） ，200mM，0.6ml 163-2101 溴酚蓝（Bromophenol Blue） ，10g 161-0404 矿物油（Mineral Oil） ，500ml 163-2129 SDS，25g 161-0300 SDS，100g 161-0301 SDS，1kg 161-0302 Tris，100g 161-0715 Tris，500g 161-0716 Tris，1 k g 1 6 1 - 0 7 1 9 Iodoacetamide，30g 163-2109 低熔点琼脂糖，2 5 g 1 6 1 - 3 1 1 1 甘氨酸，250g 161-0
16、717 甘氨酸，1 k g 1 6 1 - 0 7 1 8 甘氨酸，2 k g 1 6 1 - 0 7 2 4 丙烯酰胺（Acrylamide） ，99.9%，100g 161-0100 丙烯酰胺（Acrylamide） ，99.9%，500g 161-0101 丙烯酰胺（Acrylamide） ，99.9%，2kg 161-0103 丙烯酰胺（Acrylamide） ，99.9%，1kg 161-0107 丙烯酰胺（Acrylamide） ，99.9%，5kg 161-0108 甲叉双丙烯酰胺（Bis） ，5g 161-0200 甲叉双丙烯酰胺（Bis） ，50g 161-0201 PDA（
17、Piperazine Diacrylamide） ，10g 161-0202 PDA（Piperazine Diacrylamide） ，50g 161-0203 过硫酸氨（Ammonium Persulfate） ，10g 161-0700 过硫酸氨（Ammonium Persulfate） ，100g 161-0754 TEMED，5 m l 1 6 1 - 0 8 0 0 TEMED，50ml 161-0801 甘油 国产或 Sigma 硫尿 S i g m a 15 蛋白质 Marker 2-D SDS-PAGE Standards，500l 161-0320 SDS-PAGE Sta
18、ndards，high range，200 l 161-0303 SDS-PAGE Standards，low range，200 l 161-0304 8 SDS-PAGE Standards，broad range，200l 161-0317 Polypeptide SDS-PAGE Standards，200l 161-0326 Precision Protein Standards，unstained，1500l，150 applications 161-0362 Precision Protein Standards，prestained，500l，50 applications 1
19、61-0372 Kaleidoscope Polypeptide Standards，500l 161-0325 Kaleidoscope Prestained Standards，broad range，500 l 161-0324 Prestained SDS-PAGE Standards，high range，500 l 161-0309 Prestained SDS-PAGE Standards，low range，500l 161-0305 Prestained SDS-PAGE Standards，broad range，500l 161-0318 IEF Standards，pI
20、 range 4.45-9.6，250 l 161-0310 16 染色试剂 Coomassie Brilliant Blue R-250，10g 161-0400 Coomassie Brilliant Blue G-250，10g 161-0406 IEF Gel Staining Solution，1L 161-0434 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit 161-0435 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，1L 161-0436 Coomassie
21、Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，41L 161-0437 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，1L 161-0438 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，41L 161-0439 Bio-Safe Coomassie Stain，1L 161-0786 Bio-Safe Coomassie Stain，5L 161-0787 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，200ml 170-3126
22、SYPRO Ruby Protein Gel Stain，1L 170-3125 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，5L 170-3138 S i l v e r S t a i n K i t 1 6 1 - 0 4 4 3 Silver Stain Plus Kit 161-0450 17 注意事项 1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。尽量选用进口试剂。 2.双向电泳中使用 MilliQ 水（电导小于 1 S） 。 3.所有包含尿素的溶液加热温度不超过 30，否则会发生蛋白氨甲酰化。 9详细订货信息请参考 BIO-RAD中英文目录 10第二章 SDS
23、-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 1 溶液的配制 30% 聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙烯酰胺 4g MilliQ水 5 0 0 m l 滤纸过滤后，棕色瓶 4冰箱保存。 1.5mol/L Tris碱 pH8.8 Tris 碱 90.75g MilliQ水 4 0 0 m l 用 1mol/L HCl 调 pH至 8.8，加 MilliQ水定容至 500ml。4冰箱保存。 0.5mol/L Tris碱 pH6.8 Tris 碱 12g MilliQ水 1 2 0 m l 用 1mol/L HCl 调 pH至 6.8，加 MilliQ水定容至 200ml。4冰箱保存。 10% S
24、DS S D S 1 0 g MilliQ水 1 0 0 m l 混匀后，室温保存。 10% Ap A p 0 . 1 g MilliQ水 1 m l （用时加水溶解） 溶解后，4冰箱保存。 10电泳缓冲液 （1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3） Tris 碱 3 0 g 甘氨酸 144g 11 S D S 1 0 g MilliQ水 1 L 混匀后，室温保存。 2SDS-PAGE 上样缓冲液 0.5M pH6.8 Tris碱 2.0ml 10% SDS 4.0ml 甘油 2 . 0 m l 1% 溴酚蓝 0 . 0 5 m l MilliQ水
25、定容至 10ml D T T 0 . 1 5 4 g （用时现加） 2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制 参见附录 1。 2. 3 操作方法 1. 将玻璃板洗净、晾干、固定。 2. 按照实验要求，配制不同浓度的分离胶。将分离胶注入玻璃板夹层中，上部用 MilliQ 水、 乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓缩胶。 3. 配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。 4. 将待分析鉴定的蛋白质样品，加入等体积 2SDS-PAGE 上样缓冲液，100水浴 3-5 分钟 （插入冰浴冷却后加样） 。 5. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，小心拔去上样梳，然后
26、用注射器洗干净加样孔，检查一下电 路连通状况（注意正负及） ，然后关闭电源。用微量加样器分别吸取待分析样品，根据蛋白质浓 度和加样孔体积决定加样量。 6. 加样完毕后，接通电源，起始时用的低电流或低电压，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线 后，再加大电流（或电压） ，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 7. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面） 。 8. 染色。 2. 4 注意事项 1. 玻璃板一定要清洗干净，否则在染色时会有不必要的凝胶背景。 2. 过硫酸铵（Ap）要新鲜配制。40%的过硫酸铵储存于冰箱中只能使用 2-3 天，低浓度的过 12 硫
27、酸铵溶液只能当天使用。 3. 蛋白质从浓缩胶部分到分离胶部分转移为避免点脱尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行 （场强小于 10V/cm） 。 4. 用 Mini Protein 3 电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为 5mA/gel，待样品在 浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到 10-15mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压 为50-75V/gel， 待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后， 再加大电压到150-200V /gel。 用Protein II电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为 10mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一 条线后，再加大电流到 20-30mA/
28、gel；以电压为标准，开始进样的低电压为 75-100V /gel，待 样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到 300-400mA/gel。 13第三章 双向电泳 3. 1 溶液配制 水化上样缓冲液（I） 尿素 8 M 4 . 8 0 5 g C H A P S 4 % 0 . 4 g D T T 6 5 m M 0 . 0 9 8 g （现加） Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50 l（40%） （现加） 溴酚蓝 0.001% 10 l（1% 溴酚蓝） MilliQ水 定容至 10ml 分装成 10 小管，每小管 1ml，-20冰箱保存。 水化上样缓冲液（II） 尿素 7 M 4
29、 . 2 g 硫脲 2 M 1 . 5 2 g C H A P S 4 % 0 . 4 g D T T 6 5 m M 0 . 0 9 8 g （现加） Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50 l（40%） （现加） 溴酚蓝 0.001% 10 l（1% 溴酚蓝） MilliQ水 定容至 10ml 分装成 10 小管，每小管 1ml，-20冰箱保存。 水化上样缓冲液（III） 尿素 5 M 3 . 0 g 硫脲 2 M 1 . 5 2 g C H A P S 2 % 0 . 2 g SB 3-10 2% 0.2g D T T 6 5 m M 0 . 0 9 8 g （现加） Bio-Lyt
30、e 0.2%(w/v) 50 l（40%） （现加） 溴酚蓝 0.001% 10 l（1% 溴酚蓝） MilliQ水 定容至 10ml 分装成 10 小管，每小管 1ml，-20冰箱保存。 14 胶条平衡缓冲液母液 尿素 6 M 3 6 g S D S 2 % 2 g Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl） 甘油 2 0 % 2 0 m l MilliQ水 定容至 100ml 分装成 10 管，每管 10ml，-20冰箱保存。 胶条平衡缓冲液I 胶条平衡缓冲液母液 10ml D T T 0 . 2 g 充分混匀，用时现配。 胶条平衡缓冲液
31、II 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0 . 2 5 g 充分混匀，用时现配。 低熔点琼脂糖封胶液 低熔点琼脂糖 0.5% 0.5g T r i s 2 5 m M 0 . 3 0 3 g 甘氨酸 192mM 1.44g S D S 0 . 1 % 1 m l （10% SDS） 溴酚蓝 0.001% 100l（1%溴酚蓝） MilliQ水 定容至 100ml 加热溶解至澄清，室温保存。 30% 聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙烯酰胺 4g MilliQ水 5 0 0 m l 滤纸过滤后，棕色瓶 4冰箱保存。 1.5mol/L Tris碱 pH8.8 Tris 碱 90.7
32、5g 15MilliQ水 4 0 0 m l 用 1mol/L HCl 调 pH至 8.8，加 MilliQ水定容至 500ml。4冰箱保存。 10% SDS S D S 1 0 g MilliQ水 1 0 0 m l 混匀后，室温保存。 10% Ap A p 0 . 1 g MilliQ水 1 m l （用时加水溶解） 溶解后，4冰箱保存。 10电泳缓冲液 （1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3） Tris 碱 30g 甘氨酸 144g S D S 1 0 g MilliQ水 1 L 混匀后，室温保存。 3. 2 操作步骤 （一）第一向等电聚焦（
33、用自制的电泳上样缓冲液，17cm的胶条，pH 4-7） 1. 从冰箱中取-20冷冻保存的水化上样缓冲液（I） （不含 DTT，不含 Bio-Lyte）一小管 （1ml/管） ，置室温溶解。 2. 在小管中加入 0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各 2.5l，充分混匀。 3. 从小管中取出 400l 水化上样缓冲液，加入 100 l 样品，充分混匀。 4. 从冰箱取-20冷冻保存的 IPG 预制胶条（17cm pH 4-7） ，于室温放置 10 分钟。 5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各 1cm 左右不要加 样，中间的样品液一定要连贯。注意：不
34、要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后， 用镊子轻轻的去除预制 IPG 胶 条上的保护层。 7. 分清胶条的正负极，轻轻地将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使 得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到 胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液 16 产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶 到胶条以外。 8. 在每根胶条上覆盖 2-3ml 矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加
35、入矿物 油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳，否则将胶条置于样品水化盘 中，-20冰箱保存。 （二）第二向 SDS-PAGE 电泳 1. 配制 10%的丙烯酰胺凝胶两块。配 80ml 凝胶溶液，每块凝胶 40ml，将溶液分别注入玻 璃板夹层中，上部留 1cm的空间，用 MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚 合 30 分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的 MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，
36、用 MilliQ水冲洗。 3. 从-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置 10 分钟，使其溶解。 4. 配制胶条平衡缓冲液I。 5在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤 纸用 MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样 品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入 5ml 胶条平衡缓冲液I。 将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。 7. 配制胶条平衡缓冲液II。 8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取 多余的
37、平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面） 。再加入胶条平衡缓冲液II， 继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。 9. 用滤纸吸去 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。 将处理好的第二向凝 胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。 11.将 10电泳缓冲液，用量筒稀释 10 倍，成 1电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取 多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面） 。 13.将 IPG 胶条从样品水化盘中
38、移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1电泳缓 冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 14.将放有胶条的 SDS-PAGE 凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方 加入低熔点琼脂糖封胶液。 17 15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完 全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意 是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。 16.放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 18.在电泳槽加入电泳缓冲液
39、后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压， 待样品在完全走出 IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压） （20-30mA/gel/17cm） ， 待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 19.电泳结束后， 轻轻撬开两层玻璃， 取出凝胶， 并切角以作记号 （戴手套， 防止污染胶面） 。 20.进行染色（按照伯乐染色试剂盒上的操作步骤） 。 （三）等电聚焦程序设置 7cm 胶条 水化 50V 12-16 小时（20） 主动水化 S1 250V 线性 3 0 分钟 除盐 S2 500V 快速 3 0 分钟 除盐 S3 4000V 线性 3 小时 升压 S4 4
40、000V 快速 20,000 伏小时 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。 （30-50 A/根） 设置等电聚焦时的温度。 （20） 11cm 胶条 水化 50V 12-16 小时（17） 主动水化 S1 250V 线性 3 0 分钟 除盐 S2 1000V 快速 3 0 分钟 除盐 S3 8000V 线性 4 小时 升压 S4 8000V 快速 40,000 伏小时 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。 （50 A/根） 设置等电聚焦时的温度。 （20） 18 17cm胶条 水化 50
41、V 12-16 小时（20） 主动水化 S1 250V 线性 3 0 分钟 除盐 S2 1000V 快速 1 小时 除盐 S3 10000V 线性 5 小时 升压 S4 10000V 快速 60,000 伏小时 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。 （50-70 A/根） 设置等电聚焦时的温度。 （20） 3. 3 注意事项 （一）等电聚焦 1. 配好的尿素储液必须马上使用，或用 mixed-bed 离子交换树脂，清除长时间放置时尿素 溶液中形成的氰酸盐，预防蛋白质的甲酰化。 2. 将水化上样缓冲液分装后再储存于-20。用时，只要解冻需要量
42、，其余继续储存。水 化上样缓冲液一旦溶解不能再冷冻。 3. 将水化上样缓冲液加入蛋白样品中，终溶液中 urea 的浓度需6.5M。 4. 等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质，它能够帮助蛋白质溶解。两性 电解质的选择取决于 IPG 胶条的 pH范围。下图可提供参考。 IPG pH Range Bio-Lyte Ampholyte(Stock) Range Conc.(w/v) Sample Solution Volume Per 5ml per50ml 3-10 3-10 40% 25ul 250ul 4-7 4-6 40% 12.5ul 125ul 5-7 40% 12.5ul
43、125ul 3-6 3-5 20% 25ul 250ul 4-6 40% 12.5ul 125ul 5-8 5-8 40% 25ul 250ul 7-10 7-9 40% 12.5ul 125ul 8-10 20% 25ul 250ul 5. 下表显示的是通常推荐使用的双向电泳第一向蛋白上样量。因为样品和样品之间存在 差异，所以这种上样量仅提供参考。对于窄 pH 范围的 IPG 胶条，需要比宽 pH 范围的 IPG 胶 条上更多的样品，这是因为 pI 值不在此范围内的蛋白质在等电聚焦的过程中会走出胶条。单 pH范围 IPG 胶条的上样量是通常的 4-5 倍还多，这样就可以很好的检测低丰度的蛋白
44、质。 IPG胶条的长度 分析型的上样量 （银或 SYPRO Ruby 染色） 制备型的上样量 （考马斯亮蓝染色） 7 cm 10-100ug蛋白 200-500ug蛋白 11cm 50-200ug蛋白 250-1,000ug蛋白 19 17cm 100-300ug 蛋白 1-3mg蛋白 6. 样品溶液的上样体积见下表。这样就可以使胶条溶胀至它们原来的厚度（0.5mm） 。胶 条最少需要经过 11 小时的溶胀。即使看上去所有的缓冲液都已经被吸收，也一定要确保胶条 在槽中溶胀充分的时间。 只有在 IPG 凝胶的孔径已经溶胀充分后， 才可以吸收大分子量蛋白质， 否则大分子量蛋白质无法进入胶条。 Re
45、adyStrip TM IPG胶 条的长度 上样体积 7 cm 125ul-250ul 11cm 185ul-370ul 17cm 300ul-600ul 7. 如果在等电聚焦过程中，聚焦盘中还有很多的溶液没有被吸收，留在胶条的外面，这 样就会在胶条的表面形成并联的电流通路，而在这层溶液中蛋白质不会被聚焦。这就会导致蛋 白的丢失或是图像拖尾。为了减少形成并联电流通路的可能性，可以先将胶条在溶胀盒中进行 溶胀，然后再将溶胀好的胶条转移到聚焦盘中。在转移过程中，要用湿润的滤纸仔细地从胶条 上吸干多余的液体。 8. 带上手套用镊子去除 IPG 胶条上的保护层。将 IPG 胶条仔细的置于溶胀缓冲液上，
46、胶 面朝下，确保整个胶面都能被浸湿。 9. 在样品溶液中加入痕量的溴酚蓝对观察溶胀过程很有帮助。在覆盖矿物油之前，可以让 胶条先吸收 1 小时的液体。IPG 胶条上一定要覆盖矿物油，否则缓冲液会蒸发，使得溶液浓缩， 导致尿素沉淀。作为防止缓冲液蒸发的预防措施，矿物油必须缓缓地加在每个槽内，确保完全 的覆盖住每一根胶条。 10. 下面的表格给出了建议使用的 IPG 胶条运行的总 volt-hours。这仅提供参考，不同的 样品需要的 volt-hours 不同。 当聚焦过程无法达到最高电压时， 只要最后能达到总的 volt-hours， 且 7cm 胶条电压不低于 3000 伏，11cm 胶条电
47、压不低于 5000 伏，17cm 胶条电压不低于 7000 伏，也能对样品进行充分的聚焦。 ReadyStripIPG胶 条的长度 最高电压 建议的 Volt-Hours 7 cm 8,000V 8,000-10,000V-hr 11cm 8,000V 20,000-40,000V-hr 17cm 10,000V 30,000-60,000V-hr 11. 为使样品进入胶的效率增加，采用 50V低电压溶胀；继续以低电压梯度（200V， 500V， 1000V各一个小时）进行电泳，最后达到 10000V进行聚焦。 12. 处理预制 IPG 胶条时，一定要始终带着手套。注意预防角蛋白污染。 13. 水化上样缓冲液的成分由不同的样品决定。 14. 每根胶条蛋白质的总上样量由特定的样品，胶条的 pH范围，及最终的检测方式决定。
