1、布鲁克液质联用仪操作规程1 操作前检查1.1 检查液氮罐和高纯氮的出口压力，保证在正常范围1.2 检查洗针溶液和流动相1.3 流动相须现配并超声，缓冲盐溶液过 0.22m微孔滤膜（或者使用色谱纯的盐溶液和酸溶液）1.4 如使用溶融石英进样管，操作前应检查石英管是否拉长，确保其未超出 ESI 探针尖端。1.5 检查系统真空度，电离真空计读数（分析仪区域）应小于510 -6 Torr。1.6 检查废液液位，及时清空废液。1.7 检查液氮罐和氦气钢瓶是否有一定压力，以便为测试样品提供符合流速 和压力要求的氮气（喷雾气体和干燥气体）和氦气（碰撞气体） 。2 操作步骤及注意事项1检查并打开干燥气 (Dr
2、y gas) 和雾化气 (Nebulizer Gas)所需的氮气源；1) 如配备液氮罐，则需打开增压阀及供气阀阀门， 使罐体压力保持在 100 psi 以上，并调节减压阀出气口压力至 0.6 Mpa；2) 如配备氮气发生器，则提前半小时打开氮气发生器电源，以便使氮气能够达到 99.99%以上的纯度，再调节氮气流量至 20 L/min；2检查并打开碰撞气 (Collision Gas) 高纯氮气 N2 或高纯氩气 Ar 钢瓶（纯度要求 99.999%） ，并调节减压阀出气口压力至 0.4 Mpa；3检查机械泵泵油的水平线， 需在小窗口的 1/22/3 之间；4打开计算机，显示器电源；5打开质谱仪
3、主机电源（仪器左侧最下方） ；6启动 micrOTOFcontrol 控制软件，务必保持仪器一直处在 shutdown 状态，待真空度达到 110e-6mbar 后，才可切换至 standby 状态待机；为了保证良好稳定的实验结果，待真空度下降至 10e-7mbar 以下后，再 operate 仪器开始测试。2.2 新建液相方法打开 hystar 软件，选择 method，然后输入新建方法的名字，点击 open，开始方法的新建。在弹出的对话框中选择 edit，然后点击“wizard”进行设置。液相方法包括梯度、流速、柱温、样品盘温度、时间、进样针吸样速度等，可依次设置即可，全部设置好之后，将。
4、2.3 新建质谱方法方法一：在 otofcontrol 中，打开 method，按照自己待检测物的分子量范围及正负偏向性选择合适的质谱方法，小分子有对应的 small molecular 方法，蛋白质组有专门的 proteomics 方法。方法二（非专业人员不推荐）：在 otofcontrol 中，打开 method，选择 new，即可新建质谱方法。可以修改的参数包括以下几个方面：（1）mode 中的 Focus 为 active，line spectra calculation 为 use sum intensity，ion polarity 为 pos 或neg，mass range 调到
5、待检测物合适的分子量范围。（2）source 中 capillary pos：4500V，neg：3500。Divert valve ：source1-2 进质谱；source1-6 为discard to fluid（3）Tune 中 collision RF 小分子调到 1000-1500，大分子调到 2000-2500；low mass 视目标物分子量大小截留（例如目标分子为 500，可调为 300，去掉小分子区域的杂峰） 。（4）MS/MS 中如果想检测二级，可以勾选 auto MS/MS；precursor ions 中 cycle time 正常下为 3s（5）chromatogr
6、am 中选择 BPC根据待检测物的分子量大小和正负偏向性，先在软件自带的质谱方法中选择相应的方法，再在此方法的基础上进行优化及分段（如含盐的样品截掉前 2-5 分钟，1-6 waste） 。仪器在操作状态下 稳定 20-30 分钟后即可开始仪器质量准确度校正。2.4 仪器质量准确度校正2.2.1. 药物和酶解多肽样品，选用甲酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围 m/z 90-1200；校正模式选用 。2.2.2. 蛋白质类样品选用三氟乙酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围 m/z 200-2000；校正模式选用 。2.2.3. 校正液配制甲酸钠校正液：溶剂：异丙醇:水溶液= 1:1 并含有 0
7、.2%甲酸10mM 甲酸钠校正液： 1ml 1M NaOH + 99ml 溶剂三氟乙酸钠校正液：溶剂： 50%乙氰含有 0.1%三氟乙酸钠(TFA)2.2.3. 校正界面3.测样方式3.1 直接进样测定对于标准品或相对较纯或混合组分较少并且不含盐的药物样品， 如果仅需要进行鉴定，可以采用直接进样方法测定。3.1.1 样品用标准溶剂（50%H 2O，50%乙腈或甲醇，0.1%甲酸）溶解或稀释3.1.2 将配好的样品或标准品吸入进样器（针） ，将进样器（针）放置于进样泵中。 注意：进样器（针）内不能有气泡3.1.3 将进样器（针）直接与离子源连接（如图）注意毛细管与注射器之间需紧密连接。进样器内不
8、能有气泡3.1.4 设置进样泵的流速为 120180 微升/小时。3.2 液质联用（ LC/MS）测定样品采用常规液相色谱系统（色谱柱 2.1x150mm；流速 200-300uL/min） 。 启动 Hystar 软件，打开hystar 软件，在 sample table 中选择相应的文件并打开，然后复制一个之前做过的样品，对复制后的新的一行进行文件名，存储路径和液相质谱方法的修改（改完之后再检查一遍） 。 注：如果是新建 sample table，可以打开一个新的复制一行粘贴到新建里，因为新建的自动进样的不对。4. 输入下列参考参数4.1. 直接进样： （低流速）大约在 120180 微升
9、/小时离子源： Nebulizer 0.4 barDry Gas 4.0 L/minDry Temp 1804.2. 药物小分子样品液质联用：平均流速大约在 200-300 uL/min离子源： Nebulizer 0.8 barDry Gas 6-8 L/minDry Temp 1804.3. 酶解多肽样品液质联用：平均流速大约在 200-300 nL/min离子源： Dry Gas 3.0 L/minDry Temp 1605. 手动获得一个 MS/MS 图谱打开 MS/MS 界面，选择 MRM- 输入 列表，激活 Scan Mode。6. 后期处理6.1 打开分析文件6.1.1. 在任务
10、栏中或者在工具栏中选择按钮 均可切换到数据分析程序(DataAnalysis)，读取所获得的数据文件6.1.2. 读取数据文件被可选择 File 菜单下的 open 对话框， 所需要的显示窗口将被程序自动打开。6.1.3. 在文件对话框中选择目录 d:datastart 用鼠标键双击 test0000.d，test0001.d， test0002.d 来打开数据文件；按住 shift 键来标记所有文件并点击回车键来一次全部打开所选文件。6.1.4. 质谱图与色谱图按文件名读取并显示在 File 菜单下。在分析清单窗口下选择所需的文件，选择后图谱在各自的窗口下显示。6.2 质谱图6.2.1. 在
11、分析清单窗口下选择的结果在质谱图窗口显示。6.2.2. 通过 Masslist 参数对话框改变离子检测参数6.2.3. 下列对话框被用来在图谱中设置新的离子检测参数6.2.4. 对下一步的 Method 参数设置参见 Bruke Daltonics DataAnalysis Reference Manual6.3 色谱数据6.3.1. 完整色谱图1. 读取数据文件（ e.g. test0001.d） ，显示 TIC（ Total Ion Chromatogram）2. 读取某一个离子的色谱数据可以打开 Edit Chromatogram Traces 对话框3. 通过 Edit 菜单下选择 C
12、hromatogram 选项来打开 Traces 对话框如下图所示，选择质荷比为 622 的离子。6.3.2. 获得各组分的质谱图（ Compound spectra）使用 Find Compound 功能键，快速有效的产生各组分的质谱图；1 ）功能键 产生色谱分离过程中所有组分的质谱图。打开 Compound Spectra 窗口时，可以看到各组分的质谱图。2）功能键 产生所有采用 MS(n)步骤采集的图谱。3） 产生 MS-和 MS/MS 图7. 报告有几种可用的报告形式来输出数据，一种报告仅有质谱图，另一种报告则只有色谱图，还有一种两种图谱都保留。7.1. 直接打印：打印键 ；或者打开
13、File 菜单，选择 Print；或者通过打印预览打印，选择打印预览键 或在 File 菜单选择 Print Preview，然后在打印预览窗口下选择打印键7.1.1 报告内容下拉菜单包含了所有可选的报告内容7.1.2. 获得参数报告选择此内容的报告中包含了获得所选分析结果的参数7.1.3. 显示报告选择此内容将完全按照显示窗口打印（包括色谱窗口、质谱显示窗口、混合物质谱窗口、质谱窗口）7.2 质谱图报告内容中几种可选的质谱图形式7.2.1. 质谱清单报告报告中含所选的质谱图的 peak 清单7.2.2. 质谱图报告报告中含所选的质谱图报告7.3 色谱图报告内容中几种可选的色谱图形式7.3.1 色谱清单报告报告中含所选的色谱图的色谱峰清单7.3.2 色谱图报告报告中含所选质谱图的报告7.3.3 混合质谱图报告报告中含所选色谱图的混合质谱报告Data Analysis软件使用峰面积积分化合物搜索鉴定smartformula manuallyselect the molecular that you wantedfind the chemical formula that you wanted and right click then send it to compound crawler
