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大豆制品中胰蛋白酶抑制剂失活方法的研究进展.pdf

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1、第 15卷 第 2期 漳州职业技术学院学报 Vol.15 No.2 2013年 6月 Journal of Zhangzhou Institute of Technology June 2013 大豆制品中胰蛋白酶抑制剂失活方法的研究进展 陈 婉 (福建中检华日食品安全检测有限公司,福建 福州 350002) 摘 要 : 大豆胰蛋白酶抑制剂是大豆中主要的抗营养因子,降低了大豆制 品的营养质量和食用安全性,在大豆制品加工过程中必须使其失活。 介绍了通过热处理、微波技术、压力处理、超声波处理、高压脉冲电场、化学还原、酚类化合物络合、酶法水解、微生物发酵及亲和色谱分离等钝化大豆胰蛋白酶抑制剂的方法。

2、 关键词:大豆;胰蛋白酶抑制剂;失活 中图分类号: Q503 文献标识码: A 文章编号: 1673-1417( 2013) 02-0024-06 1 大豆胰蛋白酶抑制剂 大豆( Glycine max (L.) Merr.)蛋白含量丰富,多年的研究发现大豆具有降低血浆胆固醇含量及预防癌症、糖尿病和肥胖症等疾病等保健功能,是人类日常饮食和动物饲料的优质植物蛋白来源。大豆原产于我国,现今每年全世界的产量已经超过 24 000万吨。然而生大豆中含有的一些抗营养因子,如大豆胰蛋白酶抑制剂( Soybean trypsin inhibitor, STI)、外源凝集素和脲酶等大大降低了大豆制品的营养质量

3、和食用安全性。 Osborne等在 1917年首次报道了小鼠食用生大豆后,其生长受到了抑制。后续研究证明,动物食用了未经处理的生大豆可能会引起生长抑制、饲料转化率降低、甲状腺肿大、胰腺增大、低血糖和肝脏受损等反应。为了改善大豆制品的营养质量,抗营养因子必须在其加工过程中通过热处理或其它分离方法除去。在这些抗营养因子中, STI 降低了大豆蛋白的消化率,相对于凝集素和脲酶更能引起大豆营养价值的下降。因而在加工中一般以 STI 的残留活性来衡量大豆制品抗营养因子的残留活性。 Hackler 等的研究认为,当STI 的活性损失 90%以上,大豆制品才能达到其最高的营养价值,即最大的蛋白质效率比值,方

4、可认为该制品是安全的。 2 大豆胰蛋白酶抑制剂的结构 目前,研究者已从大豆中分离出两种类型的胰蛋白酶抑制剂,分别是 Kunitz型胰蛋白酶抑制剂( Kunitz Soybean trypsin inhibitor, KSTI)和 Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂( Bowman-Birk trypsin inhibitor, BBTI)。KSTI在 1945年由 Kunitz首次从大豆中分离得到。 KSTI在大豆中的含量约为 1.4%,其分子量约为 20 000Da,具有一个与胰蛋白酶直接结合的位点。 KSTI的氨基酸序列首次由 Koide等人测得。 Kim等人发现 KSTI由 3种非常

5、接近的亚型组成,它们都含有 181个氨基酸残基和 2个分子内二硫键。 BBTI的分子量为 6 00012 000Da,在大豆中的含量约为 0.6%,具有与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结合的位点,含有 7个分子内二硫键13。Huang等的实验结果表明, KSTI对胰蛋白酶的抑制活性强于 BBTI14。 3 失活方法 3.1 物理方法失活3.1.1 热处理 收稿日期 : 2013 01 20 作者简介: 陈 婉 ( 1982 ), 女 ,福建漳州人, 助理工程师 , 本科, 主要 研究方向: 食品 检测与加工 。 第 2期 陈 婉 : 大豆制品中胰蛋白酶抑制剂失活方法的研究进展 25 STI本身是一种蛋

6、白质,通过加热使其发生不可逆变性、失去抑制活性是大豆制品传统加工中降低 STI活性的方法。生大豆中STI 活性下降的程度与多方面因素有关,如加热的温度、时间、加热过程使用的压力、空气湿度和大豆颗粒的大小等。显然,加热温度、含水量和压力越高,加热时间越长,颗粒越小则抗营养因子的破坏程度越大。 Plahar等将大豆置于沸水处理 20min后发现大豆中 STI活性有效降低,并除去了大豆中的豆腥味15。 Qin等发现大豆经 100处理 40min后, STI活性下降至原来的 11.7;而经 118加热10min后 STI活性下降至 10.7;以 136处理 5min后, STI活性仅保留 2.416。

7、黄惠华等研究了豆奶中热处理对 STI活性的影响,结果发现热处理导致豆奶中蛋白质巯基的变化从而引起蛋白质组分的变化,在 95140范围内,温度提高 30,钝化 90% STI的热处理时间缩短为原来的 1/10;以 95加热使 90%的 STI失活需要 35 min, 120需 7 min,而 140只需 1min左右1。 干热处理与湿热处理相比,由于水蒸气比空气对热的传递具有更强的穿透性,湿热处理更有利于钝化STI的活性,因而一般的热处理均会采用湿热的方法进行。曹志华等将大豆粉置于 110(0.05MPa )下进行湿热处理,5 min 即可使 STI活性下降 96%2。 Radha等对白豆片进行

8、干热条件,处理 30min后 STI活性没有发生明显改变;而经 121 15psi处理 10min后,STI活性下降至原来的 15.6%,而处理 30min后, STI活性仅为 2.6%19。陈秋东等从节约能源和简化工艺的角度出发,先对大豆(不浸水不破碎组织)进行 90干热处理 15min,待浸水破碎后立即以 125热处理 10min,结果发现,大豆中致甲状腺肿素、外源凝集素和 STI的去除率均可达 95%以上3。 在 STI中, KSTI和 BBTI具有不同的热稳定性。由于 BBTI含有更多的分子内二硫键,因而具有更强的热稳定性。 BBTI在大多数食品基质(不同的pH 范围)中是稳定的,在沸

9、水中加热 10min或在胃肠道内受多种蛋白酶的作用均能保持活性。Magdi等研究了 KSTI和 BBTI在不同pH值下的热稳定性。结果发现, BBTI在中性和酸性条件下经沸水长时间加热后仍能保持 75以上的活性,同等条件下 KSTI仅保留 25以下的活性;但在碱性条件下,两者经沸水加热后其活性均迅速下降;在 pH 7的条件下,对 BBTI和 KTI进行 121 15psi处理 60min后, BBTI约保留 50%的活性,而此时 KSTI损失将近 96%的活性17。 为了减少热处理对大豆蛋白及大豆的一些具有生物活性物质的损害,研究者采用超高温瞬时加热( UHT)的方法对豆奶进行处理,以期在杀菌

10、的同时钝化 STI。 Kwok等采用了间接 UHT对豆奶进行杀菌,研究发现在 143加热约 60s可使 STI活性下降至原来的 10。虽然经此处理后产品在微生物指标方面达到要求,但是后续研究发现有部分产品 STI活性的残留量超过了 1018。Yuan 等发现采用传统的蒸汽杀菌,使豆奶在 100保持 20min可使 STI活性降至原来的 13%;而采用经 80浸泡 2min的大豆进行加工,最后采用 UHT杀菌,可使 STI活性下降至 10%左右;与传统产品相比,经过 80浸泡处理后,脂肪氧化酶被钝化,产品的豆腥味更少19。 虽然有报道指经热处理后 STI被钝化,同时大豆的营养质量在某些程度上得到

11、了改善。但是大豆富含蛋白质,经过热处理后大豆蛋白会发生聚集和变性,从而导致大豆蛋白的溶解度、消化率及一些功能特性下降,而与 STI 一样具有生物活性的物质也会失去活性。如果要使 STI完全失活,则必然导致对大豆的过度加热,除了会引起上述提及的大豆蛋白变性,还会使大豆蛋白中的一些必须氨基酸如蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、精氨酸和半胱氨酸等的损失。若采用热处理使大豆制品中 STI失活,必须平衡 STI在高温下被钝化和热对大豆蛋白及活性物质的破坏之间的关系,既使大豆制品达到安全的要求,同时最大程度保留大豆的营养。显然热处理很难同时达到这两方面的要求,但是热处理仍是目前大豆加工中所使用的最广泛的方法。 3.

12、1.2 微波处理 采用微波加热技术进行食品加工具有传热快速、均匀,表面温度低,物料能选择性吸收能量等优点,可较大程度地保持食品的质量,提高生产效率。 Rajko等利用微波对大豆进行处理,经过优化工艺参数,STI活性最低可下降至原来的 4.28,该研究认为微波技术用于钝化 STI具有快速、高效等优点20。 Barac等将大豆破碎后,用 2 450MHz的微波进行处理, STI活性下降至原来的 13.33%,大豆的溶解性蛋白含量和26 漳州职业技术学院学报 2013年 多肽组成受到了明显的影响21。 3.1.3 压力处理 超高压技术已被用于杀死微生物、钝化酶活和使蛋白质变性的研究中。 Van De

13、r Ven等利用超高压技术处理经浸泡的大豆和豆浆,结果发现两者的 STI活性均有下降。当以豆浆为原料,起始温度在 7790之间,压力在 525750 MPa 之间处理时间少于 2min, STI的活性可下降至 10以下22。 Haddad等采用一套瞬时降压系统(instantaneous controlled pressure drop , DIC)对大豆进行处理。 DIC是一种用于处理生物材料的水 -热 -机械处理系统。此系统将润湿的原料置于处理腔内,用水蒸汽进行升温加压(可达 170 , 8105 Pa)处理一段相对短的时间(数秒至 1分钟),然后马上打开连通一个体积至少是样品处理腔 50

14、倍的真空罐(50102 Pa )的阀门,使处理腔的压力迅速下降,并导致样品中部分水分气化而形成多孔性结构。短时的处理和处理后温度随着压力下降而迅速下降,减少了热对产品品质的破坏,而且 DIC可用于处理完整的大豆。大豆在此系统中经 1min处理, STI活性下降 94%,而处理 6min后, STI活性下降 99%23。 3.1.4 超声波处理 由于具有独特的物理化学作用,超声波处理已被应用于蛋白质和酶的钝化,因此这种处理方法也可作为一种协同的工艺应用于钝化大豆制品中的 STI。 Liang等利用 20 kHz的超声波处理豆奶中的 STI,结果表明,当处理温度为 80、功率为 150W、 pH值

15、为 7.0下处理 5min后, STI的活性下降了 73。由于剩余的STI活性是由BBTI 提供,而 BBTI对热和 20 kHz的超声波比较稳定,所以此时 STI难以被完全钝化24。黄惠华等采用频率为 20 kHz、振幅为 65的超声波场分别处理 KSTI和 BBTI。结果发现,处理后 KSTI活性下降55,圆二色谱结果显示其转角和无规卷曲的含量分别下降至 10.8和 54,而折叠的含量则增加至35.2,同时有约 71.5的二硫键转变成巯基;而 BBTI的二级结构则表现稳定,其 折叠、无规卷曲结构以及对胰蛋白酶的抑制活性基本不受影响,仅有 5.29的二硫键转化成巯基;由此认为超声波可能是通过

16、影响 KSTI的二硫键,使其二级结构发生变化,从而影响其活性4。 3.1.5 高压脉冲电场 高压脉冲电场是一种中低温食品加工和保藏方法,以高电压、短脉冲时间及温和的温度条件处理液态或半固态食品。在高压脉冲电场下,微生物会被杀死,一些蛋白质、酶被钝化。与传统的热杀菌相比,由于处理时间短、食品成分受到热的破坏较少,因而能较大程度保存食品原有的风味、口感和营养价值。李迎秋等研究了高压脉冲电场对 STI 的钝化效果。结果显示,随着脉冲强度和脉冲处理时间的延长, STI 活性有所下降,但效果不太显著,由此可知单独的高压脉冲电场处理并不能彻底钝化 STI活性。当脉冲电场和加热联合使用时,可以显著地钝化 S

17、TI 的活性,尤其是先进行脉冲处理后进行加热,钝化效果更为显著,STI活性可下降 74。 3.2 化学方法失活 3.2.1 还原剂处理 由于 KSTI和 BBTI均含有分子内二硫键,在大豆粉中添加还原剂,打断这些二硫键,改变其构型,使其不能与胰蛋白酶结合,是钝化 STI的方法之一。 Herkelman等在大豆中添加偏亚硫酸氢钠,使钝化 STI的加热时间减少一半25。 Friedman等发现当有半胱氨酸或乙酰半胱氨酸存在下, STI更容易在热处理下失活,该研究认为控制二硫键交换可能有助于使含二硫键的有毒蛋白质失活26。 Faris等通过 NADP-硫氧还蛋白系统处理白豆粉,以还原其蛋白质中的二硫

18、键,从而提高胰蛋白酶和胰酶对豆粉中蛋白质的消化率。经处理后,胰蛋白酶和胰酶对其消化率分别提高 29.3和 60.6%,两种酶对豆粉中蛋白质的水解程度与硫氧还蛋白对白豆粉的还原程度有关27。王向阳等在大豆饼粕中分别添加偏重亚硫酸钠、亚硫酸钠、维生素 C和硫酸铜以钝化大豆中的 STI,结果表明 STI活性残存率分别为 23.47%、30.86% 和 39.36%5。万娟等研究了二硫苏糖醇、亚硫酸钠和半胱氨酸对 STI活性的影响,三者对 STI的相对失活率分别达 80.14%、 77.98%和71.85%,而热处理仅为 11.20%;凝胶排阻色谱的结果也印证了还原剂使 STI的二硫键断裂,从而改变其

19、结第 2期 陈 婉 : 大豆制品中胰蛋白酶抑制剂失活方法的研究进展 27 构使其失活6。 3.2.2 酚类化合物对 STI活性的影响 由于酚类化合物对蛋白质具有极强的络合作用,因而可利用此特性,在大豆制品中添加适量酚类化合物使 STI与其结合降低 STI的抑制活性。周春晖等研究了茶多酚对 STI的影响,该研究认为添加化学试剂难免存在一些化学物质残留的问题,从而影响食品的安全性;茶多酚作为茶中的一种天然化合物,安全性更好。该研究发现茶多酚能有效络合STI ,使其对胰蛋白酶的抑制作用减弱,同时研究表明茶多酚络合钝化STI还受温度的影响7。 Huang等发现茶多酚可使 KSTI和 BBTI失活,抑制

20、效果与茶多酚和 STI的比例有关;当 STI与胰蛋白酶结合后再添加茶多酚可使STI 迅速失活;茶多酚使KSTI 失活的效果比BBTI 明显,但同时茶多酚能使胰蛋白酶失活,但只能抑制其小部分活性28。 3.3 生物方法失活 3.3.1 酶法水解 虽然 STI能与胰蛋白酶结合并抑制其活性,但是 STI本质上仍是蛋白质,在某些蛋白酶的作用下, STI会被分解。许多研究者正是利用蛋白酶的水解作用去除大豆制品中的 STI。相对于热处理,酶法降解 STI节省能源,既保护了热敏性必需氨基酸不被破坏,还可以水解外源凝集素和致敏因子等其它抗营养因子,同时使豆制品中的蛋白质水解生成短肽,更好地提高豆制品的营养价值

21、。 Azarkan等的研究发现木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、氨基乙酰内肽酶、嗜热菌蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等酶均能水解STI29。杨晓泉等添加碱性内切蛋白酶 Alcalase对大豆蛋白进行水解;经该酶的最适条件水解后,残留 STI活性为对照的 20%,可溶性蛋白含量达 27 mg/mL,游离氨基酸含量为 7.1 mg/mL,大豆蛋白的水解度为 8.9%。该研究还发现Alcalase蛋白酶可同时水解大豆蛋白和 STI,但 Alcalase仅能水解 STI中的 KSTI,而不能水解 BBTI8。李艳丽等在豆粕中添加由米曲霉( Aspergillus oryzae)发酵所得的中性蛋白酶,结果发现豆粕中

22、STI活性下降 40%,金属离子的加入普遍抑制蛋白酶对 STI的水解,酶解时间在 30 min就能达到最大的抑制效果9。陈中等从萌发的绿豆种子中分离纯化出一种可水解 STI的蛋白酶,该酶在 50、 pH 8.0、相对酶活力为 5000 BAEE/mL和 4 h的反应时间下可将脱脂大豆粉中的 STI活性钝化 90.91%,该研究还对该蛋白酶进行进一步的分离纯化,将其制备成聚丙烯酰胺固定化酶10。 3.3.2 微生物发酵去除 吴非等的研究发现,目前市场上部分大豆制品的 STI失活不彻底。其中水解蛋白、乳用蛋白、组织蛋白、水豆腐及干豆腐中 STI活性均下降了 90%以上,以组织蛋白中 STI活性最低

23、。部分经现代加工方法生产的豆制品如某些豆粉、豆浆以及内酯豆腐中 STI的失活处理不够充分。而我国传统豆制品中 STI的失活效果较好,腐乳及豆酱中 STI活性都为不可检出。这一部分的产品均经过了微生物发酵,因而 STI活性较低。该研究直接利用微生物对豆乳进行发酵,结果表明乳酸菌和霉菌发酵都能使豆乳中的 STI失活,其中以米黑毛霉和米根霉发酵钝化效果最好11。孙常灿等采用乳酸菌和枯草芽胞杆菌发酵大豆粉,两者均能去除大豆粉中的 STI12。 Hong等添加米曲霉发酵大豆粉,经发酵后,大分子多肽降解为小分子多肽,蛋白质含量有所提高,同时钝化了大部分STI 活性。反刍动物能食用未经处理的全脂大豆而不会出

24、现不适的症状,这是由于反刍动物的瘤胃中存在一些能使 STI失活的微生物30。因此, Hoffmann等人取牛瘤胃液对全脂大豆和粗饲料混合物进行体外发酵,实验结果表明,经发酵后大豆中的 STI失去活性并被降解31。 3.4 亲和色谱分离 STI 大豆中的STI 具有与胰蛋白酶结合进而降低大豆蛋白的营养价值,因而在大豆制品加工过程中需将其除去。但是随着近期研究的深入,体内及体外的系统模型中已证明了STI 对多种肿瘤细胞具有防止转移及抑制的作用,可见STI 具有一定的药用价值。如果在去除 STI的同时,将这部分的 STI收集起来,并将此作为药品或保健食品利用,可一举两得。基于亲和配体与目标蛋白间强烈

25、的相互作用,亲和色谱能将具生物活性的大分子从混合物中高特异、高效地分离出来。 Zhang等( 2008)用固定了胰蛋白酶的壳聚糖微球从大豆乳清中回收 STI,活力回收率达 69.25%,经 SDS-PAGE检测,回收产物只出现了一条分子量约为 8.3kDa28 漳州职业技术学院学报 2013年 的条带,认为此带应为 BBTI,具有较高特异性32。 4 展 望 STI 是大豆中主要的抗营养因子,降低了大豆制品的营养价值及食用安全性,在大豆制品加工过程中必须使其失活。现今的大豆制品加工大多采用热处理的方法,通过高温的作用使 STI 变性,使其失去抑制胰蛋白酶的活性。这种方法设备简单,操作方便,成本

26、较低,能有效使 STI活性下降至食用的安全范围,但是高温处理同时降低了大豆蛋白及其它一些生物活性物质的利用价值。为了在钝化 STI的同时减少对大豆蛋白等破坏,研究者提出了一些非热的方法,如:压力处理、超声波处理、高压脉冲电场、化学还原、酚类化合物络合、酶法水解和微生物发酵等方法。这些方法虽然同样能使 STI 活性大幅下降,但由于设备、成本等问题仍未能广泛应用于实际的加工中。随着近年研究的深入,研究者发现原来作为抗营养因子的 STI还具有一定的药用价值。在大豆制品加工过程中,把 STI从大豆中分离出来,既能除去产品中的抗营养因子,同时回收了大豆中的生物活性物质,从而提高了大豆的综合利用程度。利用

27、高效、高特异性的亲和色谱从大豆中分离 STI正是朝着这一方向发展,但是这一方法同样还需要解决工业化生产的问题。 参考文献: 1 黄惠华 ,郭乾初 ,梁汉华 ,高孔荣 .豆奶蛋白组分和胰蛋白酶抑制 剂活性的热变化 J.营养学报 ,2001,23(2):140-144. 2 曹志华 ,罗静波 ,田晓霞 ,肖立新 .湿热处理对大豆粉品质的影响 J.长江大学学报 ,2005,2(11):52-55. 3 陈秋东 ,于平 ,岑沛霖 .去除大豆中致甲状腺肿素、凝血素和胰蛋白酶抑制剂的研究 J.食品科学 ,2003,23(11):79-82. 4 黄惠华 ,粱汉华 ,郭乾初 .超声波对大豆胰蛋白酶抑制剂活性

28、及二级结构的影响 J.食品科学 ,2004,25(3):29-33. 5 王向阳 ,丁晓明 ,陆治年 .钝化剂对大豆胰蛋白酶抑制因子活性的影响 J.粮食与饲料工业 ,1997(1):37-40. 6 万娟 ,陈中 ,杨晓泉 ,周伟伟 .不同还原剂对大豆胰蛋白酶抑制剂的钝化研究 J.食品工业科技 ,2007a(3):82-85. 7 周春晖 ,黄惠华 .STI的抑制作用及茶多酚作用下 STI的失活探讨 J.中国油脂 ,2001,26(5):68-71. 8 杨晓泉 ,陈中 ,黄纪昆 .Alcalase蛋白酶降解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究 J.食品与发酵工业 ,2001,27(1):18-22. 9

29、 李艳丽 ,许少春 ,李孝辉 ,许尧兴 .米曲霉中性蛋白酶钝化大豆胰蛋白酶抑制剂 J.中国饲料 ,2008(4):7-10. 10 陈中 ,杨晓泉 ,赵谋明 .萌发绿豆种子中的一种大豆胰蛋白酶抑制剂钝化酶 J.植物学报 ,2001,43(11):1150-1153. 11 吴非 ,李红梅 .生物法失活大豆胰蛋白酶抑制剂的研究 J.食品与发酵工业 ,2008,34(6):1-5. 12 孙常灿 ,何晓丽 ,杨容 ,蒋晶 ,陈章宝 .大豆胰蛋白酶抑制剂微生物发酵灭活研究 J.畜禽业 ,2007, 21(8):4-6. 13 S.H.Kim, S. Hara, S. Hase, T. Ikenaka

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44、CCIC-Fairreach Food Safety Testing Co. Ltd, Fujian Fuzhou 350002) Abstract: As the main antinutriton factor in soybean, soybean trypsin inhibitor decreases the nutritional value and edible security of the soybean products. Soybean trypsin inhibitor must be inactivated during the processing of the so

45、ybean products. In this review, the methods that inactivated the soybean trypsin inhibitor, including heat treatment, microwave technique, pressure treatment, ultrasonic treatment, high intensity pulsed electric field, chemical reduction, phenol complexation, enzyme hydrolysis, microbe fermentation and affinity chromatography, were introduced. Key words: Soybean; Trypsin Inhibitor; Inactivation (责任编辑:季 平) 大豆制品中胰蛋白酶抑制剂失活方法的研究进展作者: 陈婉, CHEN Wan作者单位: 福建中检华日食品安全检测有限公司,福建 福州,350002刊名: 漳州职业技术学院学报英文刊名: Journal of Zhangzhou Technical Institute年,卷(期): 2013(2)本文链接:http:/

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