1、细胞自噬2016 年 10 月 3 日诺贝尔生理学奖授予日本科学家大隅良典，以表彰他发现并阐释了细胞自噬的机理，在细胞自噬研究方面做出了杰出贡献。日本东京工业大学分子细胞学教授大隅良典所带领的研究小组成功的探明了细胞自噬的启动机制，他的研究为理解许多机体生理过程中自体吞噬的重要性奠定了坚实的基础，为揭示生命进程的发展做出了巨大的推动作用。一、自噬的发现20 世纪 50 年代中期，科学家观察到细胞里的一个新的专门“小隔间”（这种隔间的学名是细胞器），包含消化蛋白质，碳水化合物和脂质的酶。这个专门隔间被称作“溶酶体”，相当于降解细胞成分的工作站。比利时科学家克里斯汀德迪夫（Christian de
2、 Duve）在 1974 年因为溶酶体和过氧化物酶体的发现，被授予诺贝尔生理学或医学奖。克里斯汀德迪夫，1974 年获得诺贝尔生理学或医学奖，“自噬”这个词的命名人。60 年代的新观察表明，在溶酶体内部有时可以找到大量的细胞内部物质，乃至整个的细胞器。因此，细胞似乎有将大量的物质传输进溶酶体的策略。进一步的生化和显微分析发现，有一种新型的囊泡负责运输细胞货物进入溶酶体进行降解（图 1）。发现溶酶体的科学家迪夫，创造了自噬（auotophagy）这个词来描述这一过程。这种新的囊泡被命名为自噬体。我们的细胞有不同的细胞“小隔间”，承担不同的作用。溶酶体就是这样一种隔间，里面有用于消化细胞内容物的消
3、化酶。人们在细胞内又观察到了一种新型的囊泡，叫做自噬体。自噬体形成的时候，逐渐吞没细胞内容物，例如受损的蛋白质和细胞器；然后它与溶酶体相融，其中的内容被降解成更小的物质成分。这一过程为细胞提供了自我更新所需的营养和材料。在 20 世纪 70 年代和 80 年代，研究人员集中研究阐明用于降解蛋白质的另一个系统，即“蛋白酶体”。在这一研究领域， 阿龙切哈诺沃（Aaron Ciechanover）， 阿夫拉姆赫什科（Avram Hershko）和欧文罗斯（Irwin Rose）因为“泛素介导的蛋白质降解的发现”被授予 2004 年诺贝尔化学奖。蛋白酶体降解蛋白质的效率很高，一个个单个降解蛋白质，但这
4、个机制没有解释细胞是怎么解决更大的蛋白质复合物以及破旧的细胞器的。 2016 年诺贝尔生理学或医学奖得主大隅良典曾经活跃于多个研究领域，但自从 1988 年建立了自己的实验室之后，他就主要研究蛋白质在液泡中降解的过程了。液泡也是一种细胞器，它在酵母中的地位和人体中溶酶体的地位类似。酵母细胞相对更容易进行研究，因而常被用作人类细胞的模型；寻那些在复杂细胞通路中发挥重要作用的基因时，酵母特别有用。但大隅面临着一个重大挑战：酵母细胞很小，在显微镜下不容易看清它的内部结构，因此他起初都无法确定自噬现象是否也会发生在酵母细胞中。大隅推论，如果他能在自噬行为发生的时候阻断液泡中蛋白质分解的过程，那么自噬体
5、将在液泡中累积，从而在显微镜下可见。因此，他培育出因突变而缺乏液泡降解酶的酵母细胞，并通过使细胞饥饿激发自噬。Fig.1 细胞自噬体示意图大隅良典接着利用了他改造过的酵母菌株在这些酵母挨饿时，它们的自噬体会积累起来。如果对自噬过程重要的基因被失活，那么自噬体积累就理应不会发生。大隅良典将酵母细胞暴露在一种能随机在多个基因里引起突变的药物中，然后诱导自噬过程。由于大隅良典和紧随他步伐的研究者的工作，我们现在知道细胞自噬控制着许多重要的生理功能，涉及到细胞部件的降解和回收利用。细胞自噬能快速提供燃料供应能量，或者提供材料来更新细胞部件，因此在细胞面对饥饿和其它种类的应激时，它发挥着不可或缺的作用。
6、在遭受感染之后，细胞自噬能消灭入侵的细胞内细菌活病毒。自噬对胚胎发育和细胞分化也有贡献。细胞还能利用自噬来消灭受损的蛋白质和细胞器，这个质检过程对于抵抗衰老带来的负面影响有举足轻重的意义。二、细胞自噬的过程在此过程中，自噬体的形成是关键，其直径一般为 300 900 nm，平均 500 nm，囊泡内常见的包含物有胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有 8min 左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。尽管对自体吞噬具体过程的了解还需要加强,但是人们已经勾勒出自体吞噬过程的大致轮廓:细胞质中的线粒体等细胞器首先被称为“隔离膜”的囊泡所
7、包被,这种“隔离膜”主要来自于内质网和高尔基体；囊泡最终形成双层膜结构,即自吞噬体(autophagosome),也称之为初始自体吞噬泡(initial autophagic vacuoles , AVi)；自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡(intermediate autophagic vacuoles, AVi/d)；最终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成降解自体吞噬泡(degrading autophagic vacuoles, AVd),由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。在整个自体吞噬过程中,细胞质和细胞器都受到破坏,最明显的是线粒体和内质网受损。虽然自体吞噬并不直接破
8、坏细胞膜和细胞核,但是有证据表明；在最初断裂或消化后，细胞膜和细胞核会最终变成溶酶体以消化和分解自身。Fig.2 细胞自噬过程示意图三、细胞自噬的调控3.1 泛素样蛋白系统对细胞自噬的调控泛素化是在翻译后水平上进行蛋白修饰的一种方式，参与蛋白酶体依赖性蛋白水解、蛋白功能调控、亚细胞分布和/或蛋白质互作。在泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, El)、泛素接合酶 (ubiquitin-conjugating enzyme, E2)以及泛素蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligase, E3)的连续作用下, 泛素与底物蛋白特定的 Lys 残基共价结合
9、完成泛素化。 同时，泛素化也是一种可逆性的过程，可由去泛素化酶将泛素从蛋白质上除去。泛素化主要包括以下 3 步酶促反应过程: (1)在 ATP 作用下, E1 可在其 Cys 和泛素的 C-端的Gly 之间形成巯酯键，即 E1-SHUb，从而激活泛素；(2)在 ATP 和 E2 酶作用下，泛素从 E1 转移到 E2 上，同样以巯酯键的方式结合(E2-SH Ub)；(3) E3 酶可以特异性识别底物蛋白并与之结合，与此同 时 E2 将激活的泛素直接转移到某些E3 结合的底物上，经过多个重复，多个泛素之间通过 Lys 相互连接，在底物上形成多泛素链。E1-样酶 Atg7 和 E2-样酶 Atg10
10、 泛素样反应后，泛素样蛋白 Atg12 与 Atg5 Lys130 共价耦联，Atg16L1 作为连接蛋白，增强 Atg12 和 E3 泛素连接酶样蛋白Atg5 间的互作，而后 Atg12-Atg5 与 Atg16L1 形成 E3 连接酶样 复合体并定位于 PAS。半胱氨酸酶 Atg4 酶切 LC3 并暴露 C-端最后 5 个 Gly 残基，在 E2-样酶Atg3 辅助下，与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)发生 E3-样共轭形成脂化的 LC3(LC3-II)并定位于 PAS，吞噬泡加工成为成熟自噬体。3.2 mTOR 信号通路对细胞自噬的调控mTOR(ma
11、mmalian target of rapamycin)属于 Ser/Thr 激酶，参与细胞发育、核糖体生成和代谢调控等生物学过程。mTOR 包括雷帕霉素敏感型 mTORC1和雷帕霉素非敏感型 mTORC2。mTORC1 磷酸化 ULK1-Atg13-RB1CC1-C12orf44/Atg101 复合体使其失活，从而负调控细胞自噬的形成，其活化程度可反应出自噬水平， 如果阻断 mTORC1 的功能， Ser/Thr 激酶可磷酸化 Atg1 复合体并激活自噬。mTORC2 的磷酸化能激活 Akt(PKB)和 Atg1 抑制自噬，也可上调 HIF1A(hypoxia-inducible facto
12、r 1A)的表达。 Fig.3 mTOR 上游示意图Fig.4 mTOR 下游示意图3.3 miRNA 对细胞自噬的调控microRNA(miRNA)是一类长约 22 nt 的内源性 非编码小 RNA 分子，在转录后水平调控基因的表达。研究表明，miRNA 参与细胞生长发育、炎症、肿瘤、衰老、凋亡等多种生理病理过程。近年来，还发现 miRNA 参与了细胞自噬调控，在自噬的发生和形成 中发挥重要作用。miRNA 与其靶 mRNA 3-UTR 部分互补序列配对，通过降解 mRNA 和/或抑制蛋白翻译来调控基因表达，并且 miRNA 与其靶 mRNA 的序列同源性决定了是降解 mRNA 还是抑制翻译
13、。营养饥饿、缺氧、雷帕霉素等可诱导细胞自噬，但多数 miRNA 在自噬过程的不同阶段可通过作用于 Atg 蛋白以拮抗这种诱导作用，抑制细胞自噬，对细胞造成伤害，且无细胞特异性。 在正常生长条件下， 抗凋亡蛋白家族 Bcl-2(包括 Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、 A1、Bcl-W 和 Rubicon)与 Beclin1 结合能力最强，Beclin1 BH3 结构域与 Bcl-2和/或 Bcl-xL 的疏水沟互作，负调控 Beclin1-Vps34 PI3K-p150 核心复合体的形成 和活性， 形成 Beclin1 同源二聚体抑制自噬；当自噬被诱导时， Beclin1 与 Bcl-2
14、解离启动自噬。此外，Beclin1 CCD(coiled-coil domain)结构域也可与 Bcl-2 和/或 Bcl-xL 的 BH4 结构域互作，但 miR376b、miR-216a、miR-30a、miR-30d 都可靶向 Beclin1， 抑制其表达，减弱 Beclin1 与Bcl-2 的结合和解离能力， 从而调控自噬。Atg9 作为唯一的跨膜蛋白，定位于 PAS、线粒体和高尔基复合体， 启动脂质从生物膜转运到 PAS，介导组装完整的囊泡膜，但 miR-34a 抑制 Atg9A 表达，中断囊泡成核。 Atg14L 可以调节脂激酶 Vps34 活性，并可募集 ULK1 以使 Becl
15、in1 磷酸化，但 miR-195 靶抑制Atg14，以抑制细胞自噬。PI3KC3 是 PI3K 复合体的核心蛋白，miR-338-5p 通过抑制 PI3KC3 的表达，阻断囊泡成核，从而负调控细胞自噬。3.4 细胞自噬调控的其他机制caspase 属于半胱天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl containing aspartate-specific protease)，在正常细胞中，caspase 以无活性的酶原形式存在。MOMP (mitochondrialouter membrane permeabilisation)是激活 caspase 的主要机制之一，细胞色素 C 进入到细胞质启动
16、凋亡复合体的形成，激活 caspase-9，caspase-9 被裂解后激活 caspase-3 和 caspase-7。细胞应激激活 caspase，活化的 caspase 能够启动细胞降解，调控细胞凋亡。研究发现， ATP合成增加能够抑制细胞自噬，而凋亡蛋白 caspase Dcp-1 调控自噬潮(autophagic flux)的发生。pro-Dcp-1 在线粒体聚集，Dcp-1 与核苷酸转移酶SesB 互作，降低 SesB 的稳定性并下调 ATP 的合成，从而启动细胞自噬。Atg16L1 蛋白发生 Thr300Ala/Thr316Ala 突变，能够致使 caspase-3 对 Atg1
17、6L1的降解敏感性增强， 进一步影响自噬体的形成。但此时，36kDa 和 34 kDa 裂解产物的出现，并不是由于 caspase-3 活性增强所造成的。calpain 是一种钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶， 可在 Atg5 蛋白的氨基末端进行裂解，产生一个相对分子质量为 24000 的产物， 从而驱使细胞自噬向细胞凋亡转变，将自噬与凋亡联系起来。除 Atg5 蛋白外， Beclin1、Bax 也是 calpain 的作用靶点，更说明自噬与凋亡有一定的关联性。四、细胞自噬与疾病4.1 肿瘤研究发现，多种肿瘤细胞中均存在自噬活性的改变，自噬与肿瘤发生和肿瘤细胞生长之间存在着一定关系。肿瘤的发展阶段、组
18、织类型、细胞分化状态、周围环境及特定的基因特征和信号转导途径共同影响自噬的活性与结果。对于肿瘤细胞来说，自噬起着双刃剑的作用，诱导自噬可导致某些肿瘤细胞的死亡，而在一些肿瘤细胞中发现抑制自噬也可促进其凋亡。首先，自噬是肿瘤细胞自身免受营养缺乏、电离辐射和治疗损伤的一种保护机制。在肿瘤进展过程中，因供血减少，肿瘤细胞特别是肿瘤内部细胞在缺氧和营养受限的状况下生存。低氧和营养缺失均能刺激白噬启动，通过自噬对胞内物质的降解和循环利用而改变新陈代谢，肿瘤细胞对应激作出适应性反应得以生存。如在不允许大规模增殖的肿瘤微环境下，肿瘤细胞还可以激活自噬以介导卵巢肿瘤细胞的休眠。在大多数的人类肿瘤细胞中均可观察
19、到 P13K 途径的持续活化。此外，自噬包含衰老和破坏细胞器的清除，自噬通过去除受损细胞器，保护肿瘤细胞以对抗抗癌治疗(如放疗、化疗)，使细胞逃避凋亡。其次，研究发现自噬作为一种肿瘤抑制机制，当细胞中受损细胞器产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)对 DNA 造成损伤，从而诱发肿瘤发生时，自噬可参与清理受损的线粒体和过氧化物酶体，维持细胞功能和染色体的稳定性，抑制肿瘤发生。Ding 等对 44 例肝细胞性肝癌患者进行研究，发现癌组织中 Beclin1 表达下调，由此得出自噬可能抑制肿瘤的发生。并不是所有的肿瘤自噬反应均一致，如人上皮样肺癌细胞、人子宫颈癌细胞株
20、HeLa 细胞、鼠恶性畸胎瘤细胞、淋巴细胞等。4.2 心血管疾病目前许多研究已将自噬的调节作用与心脏相关疾病联系起来，其中包括心肌病、心脏肥大、缺血性心肌病、心力衰竭及缺血损伤等。如溶酶体相关蛋白(1ysosomeassociated membrane protein 2，LAMP2)缺乏能够引起 x 连锁显性遗传性心肌病Danon 病。该类疾病患者的心脏组织中，具有线粒体功能障碍的心肌细胞内含有大量的自噬体。另外 Tannous 等发现在结蛋白相关的心肌病鼠模型中，自噬起保护心肌作用。缺血再灌注损伤模型中自噬水平提高，对刺激信号的应答反应提高。此外根据损伤的程度不同，自噬可能起着不同的作用。
21、动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中自噬体数目显著增加，同时，自噬可能通过阻止巨噬细胞凋亡以及斑块坏死从而使动脉粥样硬化斑块趋于稳定。五、展望越来越多的资料显示，自噬在多种疾病的发生、发展和治疗中占重要地位。作为抑制机制，自噬可以导致病变细胞死亡，限制细胞数量或者减少 DNA 的突变概率，防止疾病发生；作为保护机制，自噬可以保护病变细胞免受治疗药物的作用并延缓细胞凋亡。考虑自噬在人类疾病中的复杂效应，深入识别其功能将有助于找到诊断和治疗这些疾病的新靶标，这对疾病发病机制的研究具有重要意义。参考文献1. Korkmaz G, le Sage C, Tekirdag KA, Agami R, Gozuac
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