1、质粒DNA的提取、鉴定与转化分子生物学综合实验学时：18概 述要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件：（1）是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有l到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，根据标记，从而知道目的基因是否已进入受体细胞，也可根
2、据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。由于细菌质粒具备上述条件，因而它已成为基因工程中常用的载体之一。载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。质粒具有自主复制性、不相容性、多拷贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切酶单一识别位点等特点。它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿
3、主细胞的补偿。1.严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；2.松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型：一、实验目的：大肠杆菌在LB培养基上培养，用碱性裂解法快速从大肠杆菌细胞中分离、提取、纯化质粒DNA。用紫外吸收法测定质粒DNA含量；用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度；用质粒转化实验，检测质粒的生物活性。通过本实验使学生能
4、熟练掌握质粒的提取纯化、限制性内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳、大肠杆菌感受态细胞制备及转化等方法和技术。二、实验流程细菌培养物的生长细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化质粒DNA的鉴定大肠杆菌感受态细胞的制备质粒DNA的转化筛选转化子和计算转化率？思考和总结三、实验准备 1、仪器和材料微量加样器、无菌工作台、高压锅、低温高速离心机等； 1.5mL塑料离心管、枪头、培养皿（需高温灭菌）；实验材料：大肠杆菌PBLGC，含抗卡那霉素基因质粒。 2、试剂 LB培养基，配2000ml。成分如下：每升含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCI 10g，琼脂糖或琼脂（固体培养基时用）15g，用10mol/LNaO
5、H调pH至70。高压灭菌30min。 pH8.0 GET缓冲液，配100ml。成分如下：50mmol L葡萄糖，10mmolL EDTA (pH8.0)，25 mmolL TrisHCl(pH8.0)。高压灭菌30min。 pH48乙酸钾溶液，配100ml。成分如下：60mL 5molL KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O。高压灭菌30min。 0.lmolL CaCl2溶液：每100 mL溶液含CaCl2（无水、分析纯）1.1g，用双蒸水配制。高压灭菌30min。 0.2molL NaOH(内含1%的SDS)，注：临用时配；异丙醇； 7.5molLNH4Ac； 70乙醇； pH
6、8.0TE缓冲液：10 mmolLTrisHCI，lmmolL EDTA，其中含RNA酶20ugmL。 TBE缓冲液：称取Tris 2.18g、硼酸1.1g和EDTANa20.14g用蒸馏水溶解后，定容至400mL，称为TBE缓冲液（0.5TBE）；琼脂糖(电泳用)； EB染色液：将EB溶于蒸馏水或电泳缓冲液，使最终浓度达到05lugmL。避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1000倍； 40%蔗糖溶液；前沿指示剂：0.5%溴酚蓝（BPB）染色液。四、实验内容（一）质粒DNA的分离、纯化所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。1、碱裂
7、解法原理:本实验采用本实验采用碱裂解法碱裂解法进行质粒的小量制备。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。解，又能使一些蛋白质变性。用用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体和染色体DNA。两种两种DNA在强碱环境都会变性。在强碱环境都会变性。当加入当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液的酸性乙酸钾降低溶液pH值后，质粒值后，质粒DNA将将迅速复性，而染色体迅速复性，而染色体DNA分子巨大，难以复性。分
8、子巨大，难以复性。通过离心，大部分细胞碎片、染色体通过离心，大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质及蛋白质沉淀（沉淀（SDS的作用下的作用下）除去，而质粒）除去，而质粒DNA留在上清中留在上清中。再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。2、实验材料、主要仪器和试剂（1）材料：含有质粒PBLG的大肠杆菌DH5G植物表达载体PBLG结构图Bm: BamH I ; H3:HindIII; R1:ECORI; SI:SalI（2）仪器：(1)塑料离心管架（30孔）；(2) 10、100、1000L微量加样器；(3) 1.5mL塑料离心管（又称E
9、PPendorf离心管）；(4)低温高速离心机（20 000 rmin）一台；(5)无菌工作台(6)高压锅，(7)常用玻璃仪器及滴管等。（3）试剂：(1) LB培养基成分如下：每升含有胰蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCI10g，琼脂糖或琼脂（固体培养基时用）15g，用NaOH调pH至7.0。(2) pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmolL EDTA，25 mmolL TrisHCl）；(3) 0.2molL NaOH(内含1%的SDS)，注：临用时配；(4) pH48乙酸钾溶液（60mL 5molL KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O）：该溶液钾离子浓度为
10、3mol/L，醋酸根离子浓度为5molL。(5) 异丙醇；(6) 70乙醇；(7）pH8.0 TE缓冲液：10 mmolLTrisHCI，lmmolL EDTA，其中含RNA酶20ugmL。3、操作步骤1培养细菌将大肠杆菌PBLG接种在LB固体培养基上，37培养12h，挑一个菌斑接种在液体LB培养基上，37培养1216h。2从菌落中快速提取制备质粒DNA（1）在无菌工作台上取1.5mL菌液加入EPPendorf离心管中，转速10000rmin，离心lmin，去掉上清液(注意，一定要吸干上清液)。加入150lGET缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。注：溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须在使用
11、时新配制溶液。使用EDTA是为了去除细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易与细胞壁接触。(2)加入200l新配制的0.2molLNaOH（内含1SDS）。加盖，颠倒23次，使之混匀，冰上放置5min。注：SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性。(3)加入150l冰冷的乙酸钾溶液（pH48）。加盖后颠倒数次使混匀，冰上放置3-5min。(4)用低温高速离心机，转速为10000rmin，离心5min，上清液倒入另一干净的离心管中。注：乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物，在冰上放置5min是为了沉淀完全。如果上清液经离心后仍混浊，应混匀后再冷却至0重新离心。(5）另取一个Eppendorf管，转入上
12、清，并加等体积异丙醇，混匀，室温放置5min，12000rmin离心5min，弃去上清液。(6)加入200l无菌蒸馏水溶解沉淀，再加入1/2体积75molL NH4Ac，混匀后冰浴35min，以12000rmin离心5min。(7)转移上清至新管中，并加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇，室温放置5min后以12000rmin离心30min。弃去上清。(8)沉淀用70乙醇洗涤一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。(9)加入20lTE，使DNA充分溶解，置-20贮存,待用。（二）质粒DNA的含量及纯度鉴定含量测定：紫外吸收法纯度鉴定：紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳1、实验原理：（1）测定D
13、NA浓度的方法有两种：紫外光吸收法：核酸在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。220 240 260 2800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123天然DNA核苷酸总吸收值变性DNA核酸的紫外吸收特性（max=260
14、nm）纯DNAOD260/OD280=1.8纯RNAOD260/OD280=2.0对于质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。核酸的变性部分双螺旋解开无规则线团链内碱基配对在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，DNA的功能丧失。如高温、pH值、变性剂(尿素、甲醛)等。
15、加热DNA的变性过程琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速分离鉴定核酸的方法，它是用琼脂糖或优质琼脂糖粉作为支持介质的一种电泳分离方法。它主要适用于1Kb的核酸的分离，样品DNA在电泳过程中有电荷效应和分子筛效应，其迁移率大小主要与DNA的分子大小和空间构象有关，另外，凝胶浓度、电压、pH等也会影响迁移率。核酸区带观察，是利用核酸与EB结合，在紫外光下可发出橙黄色荧光的性质，借助于紫外观测仪来进行。* 荧光染料EB染色的原理EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(EthidiumBromide)。EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光
16、。激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收254nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。*荧光染料EB染色的优点：（1）染色比较简便、快捷，一般在1015min就可反应。（2）EB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做到的。（3）EB灵敏度高，可检测出10ng或更少的DNA含量。（4）既可用于DNA也可用于RNA的检测。（5）EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外灯检测电泳的进程和效果。（6）EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的EB强10倍，因此不需洗净凝胶中
17、游离的EB也可检测出DNA的条带。*缺点：溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；（2）室温下放置1小时，不时的摇动；（3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；（4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。*溴乙啶在260分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。2、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：质粒DNA2、仪器：(1)稳压稳流电泳仪(2) 可调微量移液器(3)水平电泳槽（4）紫外分光光度计(5)紫外透射仪等3、试剂：（1）电泳缓冲液：Tris-硼酸（1TBE）pH8.0。（2）加样缓冲液（6）：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。（3) 溴化乙锭（EB）溶液：10mg/ml
