1、综述 Review * E-mail: Received April 2, 2015; published May 21, 2015. Project supported by the Research grants (No. 81490740 and No. 21472008) from the National Natural Science Foundation of China. 项目受国家自然科学基金委重大项目 (No. 81490740)和面上项目 (No. 21472008)资助 . Acta Chim. Sinica 2015, 73, 657668 2015 Shangha
2、i Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 657化 学 学 报 ACTA CHIMICA SINICA 基于活性的蛋白质组分析 王初*,a,b,c,d,e陈南c(a北京大学分子科学国家实验室 , b生物有机与分子工程教育部重点实验室 , c北京大学化学与分子工程学院 , d合成与功能生物分子中心 , e北大清华生命科学联合中心 北京 100871) 摘要 众多物种基因组解码工作的完成极大地丰富了我们对这些生命体系组成复杂度的认知 , 然而下一个更为严峻的挑战是如何快速准确地解析这些基因编码
3、蛋白的分子功能 , 这也是当前蛋白质组学领域亟待解决的一个重要科学问题 . 基于活性的蛋白质组分析是近些年来一项新兴的技术平台 , 它致力于在复杂的生命体系中系统地鉴定某类具有特定功能的蛋白质分子 . 在本篇短综述中 , 我们将对该化学生物学技术的发展做一个简要的回顾 , 重点介绍该技术在未知蛋白的功能解析、小分子抑制剂的筛选以及活性小分子靶标蛋白的鉴定等方面的工作 , 最后将对该技术未来发展的走向及其拓展应用做前瞻性的讨论 . 关键词 活性分子探针 ; 化学蛋白质组学 ; 蛋白功能解析 ; 抑制剂研发 ; 靶点鉴定 Activity-based Protein Profiling Wang,
4、 Chu*,a,b,c,d,eChen, Nan c(aBeijing National Laboratory for Molecular Sciences, bKey Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineer-ing of Ministry of Education, cCollege of Chemistry and Molecular Engineering, dSynthetic and Functional Biomolecules Center, and ePeking-Tsinghua Center for
5、 Life Sciences, Peking University, Beijing 100871) Abstract Genome sequencing projects have revolutionized our view of the complexity of prokaryotic and eukaryotic pro-teomes, however, we are also left with a daunting challenge of functionally annotating these large number of predicted pro-teins. Ac
6、tivity-based protein profiling (ABPP) has been developed as a powerful chemoproteomic tool aiming at systemati-cally discovering and assigning functions of uncharacterized enzymes directly from native proteomes. Here, we reviewed the development and application of this emerging technique, mainly foc
7、using on how it was applied for functional annotation of unknown enzymes, screening and optimization of small-molecule inhibitors, and target identification of bio-active small molecules. Keywords activity-based probe; chemical proteomics; protein functional annotation; inhibitor development; target
8、 identifi-cation 1 引言 根据 Genomes Online Database (GOLD, https:/ gold.jgi-psf.org/)数据库的统计 , 截止到 2014 年底 , 接近8000 个物种的基因组解码工作已经完成 , 另外有近12000 个物种的基因组解码工作正在进行中 . 按照分子生物学中心法则 , 每一个基因都会通过转录和翻译产生与其相对应的蛋白质分子 , 因而与每个物种基因组对应的是其复杂多变的蛋白质组 . 近些年来 , 在基因组学发展的大力推动下 , 蛋白质组学的研究也如火如荼地开展起来1 8. 这些研究通过运用酵母双杂交9,10、二维凝胶电泳
9、11,12以及生物大分子质谱13 18等技术致力于大规模分析鉴定蛋白质在生物体系内的丰度 , 定位以及和其它生物大分子之间的相互作用 , 获取了大量有价值的信息 , 极大地推动了我们对于生命体系复杂度的认知 . 然而 , 蛋白质作为生命过程中的各种重要功能的最终执行者 , 其在生物体内的活性经历着时间和空间上的严格调控 , 而这些活性的变化对一些生理和病理过程产生的影响通常比蛋白本身丰度的变化所带来的影响更大 . 因此 , 如何大规模准确迅速地在复杂生物体系内分析获取蛋白功能活性的信息成为了蛋白质组学亟需解决的一个重要科学问题 . 在蛋白质翻译表达后 , 生物体对其功能活性的调控往往是通过化学
10、手段进行的 , 例如磷酸化修饰可以激活蛋白开启细胞内信号转导19; 泛素化修饰可以导致靶蛋白被蛋白酶体降解 , 维持生物物质平 衡20; 乙酰化可以改变组蛋白与核酸分子之间的相互作用 , 从而调节基因表达21. 除了这些重要的翻译后修饰外 , 生物体内的许多蛋白酶都经历着从没有活性的酶前体到有活性的酶再到失去活性的酶-抑制剂复合体这样一个动态调节过程22,23, 而这样一个失活、激活再失活的过程也密切地反映了蛋白酶活性催化中心的化学DOI: 10.6023/A15040223 化 学 学 报 综述 658 http:/sioc- 2015 Shanghai Institute of Organ
11、ic Chemistry, Chinese Academy of Sciences Acta Chim. Sinica 2015, 73, 657668变化 . 因此 , 在蛋白质组水平上研究蛋白功能活性变化需要引入更多化学的技术和方法 . 在本篇综述中 , 作者将介绍一项叫做“基于活性的蛋白质组分析” (Activity- based Protein Profiling, ABPP)的新兴技术24, 回顾该技术在未知蛋白的功能解析、小分子抑制剂的筛选、活性小分子靶标蛋白的鉴定以及后翻译修饰位点的发现等方面的工作 , 最后对该技术未来发展的走向及其拓展应用做前瞻性的讨论 . 2 ABPP 简介
12、 ABPP 方法的核心是设计一个可以在蛋白质组内与某一类蛋白酶活性中心氨基酸残基发生共价反应的“活性分子探针” (Activity-based Probe, ABP). 由于 ABP 对蛋白的化学修饰是发生在决定其生物活性的催化中心的 , 因此我们可以通过该探针标记水平的高低在复杂的蛋白质组内即时读取这类蛋白酶的活性功能状态 . 如图1 所示 , ABP 的设计通常包括两个基本组成部分 : “反应基团”和“报告基团” , 一般通过碳链或者聚乙二醇链将二者连接在一起 . 反应基团通常是具有独特化学结构的亲电性化学小分子 , 能够选择性地与蛋白质组中某一类蛋白酶的活性中心结合 , 并与其中执行重要
13、催化功能的亲核性氨基酸发生反应 , 从而将探针分子共价地标记在靶标蛋白上 . 对于那些通过非共价结合方式与蛋白质发生作用的活性小分子 , 分子探针的设计则需要额外引入一个光交联基团 . 活性小分子作为探针中的“结合基团”可以特异性地识别靶蛋白并发生非共价结合 , 同时拉近了探针中光交联基团和靶蛋白的空间距离 , 经紫外光照射 , 光交联基团产生自由基并与空间邻近的氨基酸发生交联 , 从而实现了探针与靶蛋白的共价标记 (图 1). 活性分子探针中的“报告基团”的作用是精确地反映出反应基团在蛋白质组中对靶标蛋白进行标记水平的高低 , 并可以将被探针标记的靶蛋白选择性地富集出来 , 通过后续实验方法
14、加以分析和鉴定 . 活性分子探针中的报告基团通常也包括两类 : 一类是诸如罗丹明、 荧光素、Cy3/Cy5 等的荧光基团 , 当被探针标记的蛋白质组在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)上分离时 , 被标记的蛋白就会显示出特定的荧光信号便于检测24. 另一类是生物素基团 (Biotin), 被探针标记的蛋白既可以通过免疫印迹法检测 , 还可以被特异的富集出来 , 然后通过生物大分子质谱进行分析 , 确定这些被探针标记的蛋白成分25(图 1). 随着生物正交反应26 29的发展和创新 , 活性分子探针中的报告基团逐渐被惰性的生物正图 1 活性分子探针结构示意图，包括一个反应 (或
15、结合 )基团 (黄色 )和一个报告基团 (紫色 ), 两个部分由中间的 Linker 连接在一起 , Linker 一般为碳链或聚乙二醇链 ; 左侧列举了一些反应基团 : 丝氨酸水解酶抑制剂 fluorophosphonate (FP), 木瓜蛋白酶抑制剂 E-64 活性分子探针(E-64-based-ABP), 蛋白激酶 Type II 抑制剂活性分子探针 (Kinase-ABP), 基质金属蛋白水解酶抑制剂 GM6001活性分子探针 (MMP-ABP). 其中 FP和 E-64-based-ABP 结构中红色部分为活性反应基团 , 而 Kinase-ABP 和 MMP-ABP 中蓝色部分为
16、光交联基团 ; 右侧为报告基团的例子 , 如荧光基团罗丹明 (TAMRA)以及可用于免疫印迹检测和亲和素 (Avidin)富集的生物素 (Biotin)基团 Figure 1 Diagram of a typical activity-based probe (ABP), consisting of a reactive (or binding) group (yellow) and a reporter group (purple), which are connected via a linker that is commonly composed by a carbon or polye
17、thylene glycol chain. Examples of selected reactive or binding groups are shown on the left including: Fluorophosphonate (FP) Probes for Serine Hydrolases, E-64-based ABPs for the papain class of cysteine proteases, ABPs based on Type II ATP-competitive inhibitors, photoreactive hydroxamate-based AB
18、Ps for metalloproteases. In the structures of FP and E-64-based ABPs, reactive groups are colored in red and in the structures of Kinase-ABP and MMP-ABP, the photo-crosslinking moieties are colored in blue; Examples of the reporter groups are shown on the right, such as TAMRA and Biotin 化 学 学 报 综述 A
19、cta Chim. Sinica 2015, 73, 657668 2015 Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 659交反应基团 (例如炔基和叠氮基 )所取代 , 在探针标记完成后 , 再利用诸如“点击化学 (铜催化的叠氮-炔基环加成反应 , Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition, CuAAC)”30之类的生物正交反应在探针上连接上荧光素或生物素这样的报告基团31(图 2). 这样的设计可以大大减小活性分子探针的整体空
20、间位阻 , 有利于探针在细胞和组织中进行活体标记 , 同时使得反应基团的设计与合成不再依赖于某一特定的报告基团 , 简化了探针合成的步骤 . 与此同时 , ABPP实验中使用的生物正交报告基团也在不断的更新发展中 , 从初期的双功能设计 (一端是生物正交基团 , 另一端是荧光素或生物素 )到中间连接处带有可被蛋白酶32、还原剂33,34、酸35、以及 光36切割基团的三功能设计 . 使用这样三功能的报告基团可以在把探针标记的蛋白富集出来后 , 在固相柱上做进一步的切割 , 减少富集中存在的背景假阳性蛋白 , 同时还可以选择性的富集和释放含有被探针所标记氨基酸位点的肽段37, 对其进行质谱分析而
21、鉴定被探针修饰的靶标蛋白活性位点 . 综上所述 , ABPP是一项基于活性分子探针的化学蛋白质组学技术 , 它利用化学分子探针中反应基团完成对蛋白质组中某一类蛋白酶活性位点的共价标记 , 然后通过探针上的报告基团将被标记的蛋白加以富集然后再通过生物大分子质谱分析鉴定蛋白成分和位点信息 , 从而在复杂的蛋白质组体系中直接获取这类蛋白酶的活性功能状态信息 . 在下面的章节里 , 作者将对 ABPP 的一些具体实例和应用做简要的介绍 . 3 针对不同蛋白家族设计的活性分子探针 生物体内的蛋白质分子按其序列、结构和功能的相似性与保守性可以被归类到多种多样的蛋白家族中 . 正是利用这些家族成员活性中心的
22、相似性 , 我们可以设计和优化针对不同家族的特异性活性分子探针 , 在复杂的蛋白质组体系内直接检测其成员蛋白的功能状态 . 迄今为止 , 化学生物学家们已经报道了多个活性分子探针的合成与优化工作 , 这些探针作用的靶标涵盖了诸如丝氨酸水解酶、半胱氨酸蛋白水解酶、蛋白激酶、糖苷酶、金属蛋白酶以及氧化还原酶等许多执行重要生理功能的蛋白家族 . 下面将对这些有代表性的活性分子探针做简要介绍 . 3.1 丝氨酸水解酶 (Serine Hydrolases) 丝氨酸水解酶是蛋白质组中非常重要的一个蛋白家族 , 其成员在生物体内催化底物分子中酰胺键、酯键和硫酯键的水解断裂 , 包括了蛋白水解酶、磷脂水解酶
23、和硫酯水解酶等38. 这些水解酶共有的特点是都包含有一个丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸 (或谷氨酸 )的催化中心三联体 . 由于三联体中的丝氨酸具有较高的亲核性 , 可以被亲电的有机磷化学小分子所共价修饰 , 因而导致水解酶失去活性39(图 3). 利用这一化学反应特性 , 美国 图 2 ABPP 实验示意图 . 活性蛋白质组被带有生物正交反应基团 (例如炔基 )的活性小分子探针标记后 , 借助点击化学反应 (CuAAC)连上罗丹明(Rh)或者生物素 (B)报告基团 , 通过 SDS-PAGE 可以直接检测罗丹明标记的蛋白质组 , 通过生物大分子质谱可以对富集的蛋白质组进行鉴定 Figure 2 A
24、 schematic representation of an ABPP experiment. An activity-based probe (ABP) bearing a bio-orthogonal group (such as an alkyne) is add-ed to native proteome and a subset of proteins are covalently labeled by the ABP. Then Copper Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddtion (CuAAC) “click-chemistry” is perf
25、ormed to conjugate azide-functionalized reporter groups, such as rhodamine(Rh) and biotin(B), to analyze the activity-based la-beling events. The Rhodamine-tagged proteome can be visualized by in-gel fluorescence and the biotinylated proteins can be enriched and characterized by mass spectrometry 化
26、学 学 报 综述 660 http:/sioc- 2015 Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences Acta Chim. Sinica 2015, 73, 657668图 3 丝氨酸水解酶的活性分子探针 . (a)丝氨酸水解酶共有的催化中心三联体结构和 Fluorophosphonate (FP)反应基团发生共价反应的示意图 ; (b) FP 活性分子探针结构 , 包括罗丹明报告基团 , 生物素报告基团和炔基生物正交报告基团 Figure 3 The activity-based probe fo
27、r serine hydrolase. (a) The Fluorophosphonate (FP) warhead covalently modifies the catalytic serine residue at the active site of serine hydrolases; (b) Structures of FP-based probes, with different reporter groups including rhodamine, biotin and a bioorthogonal alkyne groupScripps 研究所 Benjamin F. C
28、ravatt 教授课题组设计一个带有氟膦酸 (fluorophosphonate, FP)反应基团的分子探针 , 可以在蛋白质组中直接标记丝氨酸水解酶家族成员活性位点的丝氨酸 . 由于探针的标记反应要求活性中心的三联体结构保持稳定 (以维持丝氨酸的亲核性 )而且不被阻碍 , 所以处在酶前体或失活 (加热、加入蛋白变性剂或蛋白酶抑制剂 )状态下的丝氨酸水解酶都无法被该探针所标记24. 由此 , Cravatt 教授及同事在该文中首次提出了“基于活性的蛋白质组分析” (Activity-based Protein Profiling)这一全新概念 , 强调了通过活性分子探针(Activity-ba
29、sed probes)标记水平检测的不是蛋白酶的整体丰度而是它在特定时空条件下的“活性功能”状态 . 3.2 半胱氨酸蛋白水解酶 (Cysteine Proteases) 半胱氨酸蛋白水解酶是蛋白质组中另一大类具有重要功能的蛋白酶40, 例如细胞凋亡蛋白酶 (caspases), 组织蛋白酶 (cathepsins)家族等 , 这些蛋白酶的活性中心都具有一个亲核性很强的半胱氨酸作为催化残基 . Stanford 大学的 Bogyo课题组利用固相合成的方法合成了一系列可以选择性标记半胱氨酸蛋白水解酶活性位点的分子探针 . 这类探针用亲电性的酰氧基甲基酮(acyloxymethyl ketone,
30、 AOMK)作为反应基团 , 然后通过在反应基团的旁边位置引入不同的化学基团或氨基酸来模拟不同蛋白酶的底物结构 , 由此获得了针对不同半胱氨酸蛋白水解酶家族的选择性41(图 4). 该系列探针的成功应用为活性分子探针设计提供了一个新的思路 , 也就是将纯粹的化学反应基团与模拟酶天然底物的结合基团相互融合在一起 , 既可以实现对活性中心催化残基的共价标记 , 同时利用合适的结合基团进一步增加探针对部分蛋白酶家族成员的高效选择性 . NHHNNHHNOOOOOOH125IOHNOOSHNHNOHHRR544-H (Gly-AOMK)-CH2CH2CH2NHC(N)NH2(Arg-AOMK)-CH2
31、CH2(CH3)2(Leu-AOMK)= -CH2CH2CH2CH2NH2(Lys-AOMK)-CH2C(O)OH (Asp-AOMK)-CH2C(O)NH2(Asn-AOMK)图 4 基于 acyloxymethyl ketone (AOMK)反应基团的半胱氨酸蛋白水解酶活性分子探针 Figure 4 Structures of activity-based probes for cysteine proteases with acyloxymethyl ketone as reactive group 3.3 蛋白激酶 (Protein Kinases) 人类基因组中大约编码 500 个蛋
32、白激酶 , 占基因总量的 2%左右42. 蛋白激酶催化底物蛋白上的磷酸化修饰 , 影响其结构和功能 , 从而调控细胞内信息传递通路 . 所有的蛋白激酶的活性中心都含有一个保守的亲核性赖氨酸位点 , 参与催化三磷酸腺苷 (ATP)提供的磷酸根向底物蛋白上的转移43. 利用这一结构上的保守性 , Patricelli 及同事发展了一个含有针对蛋白激酶的活性分子探针44. 该探针含有一个 ATP(或二磷酸腺苷 ADP)核苷酸的结合基团、一个磷酰基 (acyl phosphate)的反应基团和一个带有 biotin 的报告基团 (图 5a). 其中 , ATP 可以帮助探针选择性地结合到蛋白激酶的 A
33、TP 底物结合域上 , 然后 acyl phosphate 反应基团会与临近保守的赖氨 化 学 学 报 综述 Acta Chim. Sinica 2015, 73, 657668 2015 Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 661图 5 蛋白激酶的活性分子探针 . (a)以磷酸腺苷 (ATP 或 ADP)作为结合基团的蛋白激酶活性分子探针 (BHAcATP 和 BHAcADP)的结构示意图 , 该探针还含有一个 acyl phosphate 作为反应基团和一个 bio
34、tin 作为报告基团 ; (b) BHAcATP 探针标记蛋白激酶的反应机理 . 当探针中 ATP 结合基团与蛋白激酶中的 ATP 底物结合域相互作用时 , 激酶中临近的保守赖氨酸残基会进攻探针中 acyl phosphate，释放 ATP 分子 , 同时使 biotin 报告基团通过酰胺键共价标记在蛋白激酶上 ; (c) 以 type II 蛋白激酶抑制剂作为结合基团的蛋白激酶活性分子探针 , 探针对靶标激酶的共价标记通过光交联基团完成 , 而探针中的炔基基团可以通过生物正交反应连接相应的报告基团 Figure 5 Activity-based probes for protein kina
35、ses. (a) Structures of kinase probes BHAcATP and BHAcADP with ATP or ADP as binding groups, acyl phosphate as reactive group and biotin as reporter group. (b) Mechanism of BHAcATPs labeling of target kinases. The ATP binding group guides the probe into the ATP-binding pocket of a target kinase where
36、as a conserved lysine residue will react with the acyl phosphate group, resulting in release of ATP and covalent attachment of the biotin reporter group to the target kinase via the newly formed amide bond. (c) Structures of kinase probes developed based on type II kinase inhibitors, which contain a
37、 photo-crosslinking group for covalent labeling and a bio-orthogonal alkyne handle酸发生化学反应 , 释放 ATP 或 ADP, 导致含有 biotin 报告基团的那部分探针共价连接到蛋白激酶上 , 完成对激酶的选择性标记 (图 5b). 后续对标记蛋白的富集和质谱分析在人类蛋白质组中鉴定到超过 75%的已知蛋白激酶 , 而且探针对激酶的标记可以被激酶抑制剂所竞争抑制45. 该活性分子探针为直接定量分析不同疾病状态下细胞内激酶活性 , 寻找全新的激酶靶标蛋白 , 以及开发高选择性的激酶抑制剂药物提供了强有力的工具
38、 . 此外 , Ranjitkar 和同事利用蛋白激酶 Type II 型抑制剂的分子结构作为基本骨架 , 通过化学合成引入了光交联和生物正交基团 , 改造后的分子探针可以细胞裂解液和活细胞中标记众多的蛋白激酶46(图 5c). 3.4 金属水解酶 (Metallohydrolase) 这类水解酶的一个共同的特点是在活性中心有一个金属锌离子的结合位点 , 而进攻底物分子的亲核基团正是来自于被锌离子激活的水分子47. 由于金属水解酶缺乏一个像丝氨酸或半胱氨酸一样的具有高反应活性的催化残基 , 针对这类蛋白酶的活性分子探针的设计采取另外一种截然不同的策略 : 探针与靶标蛋白的共价连接是通过探针上的
39、光交联基团完成的 , 而探针与靶标蛋白结合的特异性则通过将这些蛋白的可逆型抑制剂引入到探针中作为结合基团而实现的 . Saghatelian 及其同事利用了基质金属蛋白水解酶 (Matrix Metalloproteinas-es, MMP)的广谱高效抑制剂 GM6001(图 6a)设计了针对此类蛋白酶的的活性分子探针48. GM6001 含有一个异羟肟酸基团 (hydroxamate)可以螯合酶活性中心的锌离子 , 他们将 GM6001 中 P2 位吲哚官能团改造成二苯甲酮 (benzophenone), 并且在抑制剂的尾部加上了罗丹明荧光基团 (图 6b, HxBP-Rh). 当探针以可逆
40、的方式结合到 MMP 活性位点后 , 在紫外光光照的条件下 , 二苯甲酮产生自由基 , 与临近的蛋白主链或侧链基团产生交联 , 使得探针可以共价地结合到靶蛋白上 . 由于GM6001 与 MMP 的结合只发生在被激活的蛋白酶上 , 因此运用该探针可以直接检测蛋白质组中 MMP 的活性状态 . 在后续的研究工作中 , Sieber 及其同事将该方法进一步发展 , 建立了一个针对金属蛋白酶的小分子探针 化 学 学 报 综述 662 http:/sioc- 2015 Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Science
41、s Acta Chim. Sinica 2015, 73, 657668HONHNHOOOHNZnHis HisHisHONHHNNHTAG-RhOOH OOOOHHNNHOONHOOS1S2HxBP-RhSAHA-BPyne(a) (b)(c)图 6 金属水解酶的活性分子探针 . (a)广谱高效可逆的 hydroxamate 抑制剂 (GM6001)和基质金属蛋白水解酶 (MMP)活性位点相互作用示意图 ; (b) 基于 GM6001 结构设计的 MMP 活性分子探针 , HxBP-Rh; (c)组蛋白去乙酰化酶的活性分子探针 , SAHA-BPyne Figure 6 Activity-b
42、ased probes for metallohydrolases (a) Diagram illustrating the interaction between matrix metalloproteinase (MMP) and its reversible hydroxamate inhibitor (GM6001). (b) Structure of an MMP-directed activity-based probe, HxBP-Rh. (c) Structure of an activity-based probe, SA-HA-BPyne, for profiling hi
43、stone deacetylases (HDACs)库 , 将探针“鸡尾酒”混合物加入到蛋白质组中 , 可以检测分析超过 20 种金属蛋白酶49. 另外一个与此设计理念类似的例子是针对组蛋白去乙酰化酶 (Histone Deacetylase, HDAC)的活性分子探针 . 基于 HDAC 的可逆抑制剂 SAHA 的结构 , Salisbury 和其同事合成了一个带有 SAHA-benzophenone-alkyne (SHAH-BPyne)的探针 , 并实验证实了其在蛋白质组中对多个 HDAC 家族成员蛋白的选择性标记50,51(图 6c). 3.5 针对其它蛋白家族的活性分子探针 除了上述
44、这些例子以外 , 活性分子探针合成及应用在近些年来被逐渐地拓展到更多的蛋白家族中 , 包括糖苷酶52 55、细胞色素 P450 (Cytochrome P450)56,57、磷酸酶 (phosphatase)58,59、 去泛素酶 (deubiquitinase)60等等 . 这里就不再对它们一一赘述 , 但纵观它们的设计思路都没有离开我们之前提到 ABPP 的基本理念 : 探针需要通过亲电或光交联反应基团选择性地与蛋白活性中心位点发生共价连接 , 然后通过报告基团来检测探针在靶标蛋白上的标记水平 , 或者进一步富集被标记蛋白做质谱鉴定分析 . 3.6 针对活性氨基酸残基的分子探针 蛋白酶活性
45、中心的氨基酸残基由于要参与催化反应 , 因此它们通常是内在化学反应活性较为活泼的氨基酸 , 包括半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸等 . 这些活性氨基酸残基也是蛋白质后翻译修饰的主要对象 , 在被修饰后影响蛋白结构和功能 , 起到重要的调节作用 . 因此探索和优化活性分子探针中亲电基团的反应活泼性和对不同氨基酸残基的反应选择性也是一个重要的研究方向 . 有机膦反应基团一直以来是标记蛋白酶活性中心丝氨酸位点的最佳选择 , 然而受到丝氨酸水解酶抑制剂筛选工作的启发 , Chang 和同事进一步探索了氨基甲酸酯 (carbamate)作为反应基团的分子探针在蛋白质组中的反应活性和选择性 ,
46、研究发现多种含有carbamate 结构的化学基团可以选择性地与小鼠体内不同的丝氨酸水解酶活性中心的丝氨酸残基发生共价反应61. Weerapana 和同事合成了一系列只带亲电反应基团和生物正交基团的分子探针 , 探索了这些亲电基团在蛋白质组中的反应选择性 , 结果发现不同亲电基团与不同氨基酸的反应活性截然不同 , 例如氯代乙酰胺(chloroacetamide)探针只和半胱氨酸发生反应 , 而苯磺酸酯 (phenylsulfonate ester)探针则还可以与天冬氨酸、 谷氨酸和组氨酸等其它活泼氨基酸发生反应62. 在该研究中 , 由于作者需要查证被分子探针标记的具体氨基酸位点 , 他们使
47、用了一个在前一章节提到的“三功能”的生物素报告基团 , 可以把含有被探针标记位点的肽段从富集的固相柱上选择性酶切释放出来 , 然后在质谱上准确鉴定被修饰的氨基酸的成分和位置37. 利用类似的方法 , Shannon 和同事合成了一系列带有芳香族卤化物的分子探针 , 结果发现了分别针对半胱氨酸和赖氨酸的特异性分子探针63. 对于其它活泼的氨基酸残基 , 具有高反应活性和高特异性的分子探针还有待发展 , 或许从早期经典的关于蛋白质化学修饰的文献中我们可以获得更多启发 , 发掘到合适的化学反应基团作为新的分子探针 . 4 ABPP 的应用 随着针对多个蛋白家族的活性分子探针的设计和下游分析技术的不断
48、成熟 , ABPP 已经开始被广泛地运用于化学生物学的诸多分支领域 , 帮助我们发现和回答许多重要的科学问题 . 在下面的章节里 , 作者将对化 学 学 报 综述 Acta Chim. Sinica 2015, 73, 657668 2015 Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 663ABPP 目前应用较多的几个方向做简要的介绍和陈述 . 4.1 运用 ABPP 在蛋白质组中发现和检测活性蛋白 由于 ABPP 技术的核心理念是运用化学探针在蛋白质组中标记具有功能活性的蛋
49、白 , 因此该项技术的一个最直接的应用就是在复杂的生物体系内发现这些具有功能活性的蛋白 , 并比较分析这些蛋白在不同生物表型、状态和条件下活性功能发生的变化 . 传统的生物标记物 (biomarker)的发现、分析和检测通常是基于基因编码蛋白的绝对水平 , 然而一种蛋白质的绝对丰度高并不意味着它的功能活性状态也高 , 因为蛋白质在翻译表达后 , 各种各样的翻译后修饰在时间和空间上动态地调节着它们的生物功能 . 而 ABPP 技术的应用可以很好地突破这一限制 , 例如 , 在运用活性分子探针标记从健康细胞和癌变细胞提取的蛋白质组后 , 我们可以通过比较探针标记信号的差异来发现和检测在癌变细胞中功能活性发生急剧变化的蛋白 , 并针对它们设计实验来进一步验证其功能变化对癌变进程的影响 (图 7). 同时
