1、冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以 CD4 为例)（1） 冰冻切片室温晾干 15分钟；（2） 用组化油笔将待染组织圈好，置 PBS中浸泡 10分钟，以去除 OCT；（3） 用含 10正常山羊血清的 PBS 室温封闭切片 1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4） 加入 CD4 单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA )，4孵育过夜；（5） PBS洗 3次，每次 10分钟；（6） 加入罗丹明标记的羊抗小鼠的 IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37孵育1小时；（7） PBS洗 3次，每次 15分钟；（8） 封片后，荧光显微镜观察结果
2、并拍照；（9） 在每切片中随机选择 5个视野计数阳性细胞数。注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注 1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂 0.3%TrixtonX100。附注 2：所用液体（表面分子染色不用 0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS： 配 方 为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0. 1MPBS 配 方 为：Na2HPO4 23g+NaH2PO42H2O 5.9g+NaCl 17g 定 容 至 2000ml, 高 压，pH7.2-7.4
3、（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100pH7.4 0.01MPBS，分装 15ml/支20保存（3）封闭液：10NGS0.3% TrixtonX100 pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支20保存（4）抗体稀释液：1BSA0.3% TrixtonX100pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支20保存一、操作方法及步骤：取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为 24242mm。取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。将冷冻
4、好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在 510um 间。 二、冰冻切片时的注意事项：防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。放置组织冰冻前，应视组织的形状
5、及走势来放置，所谓“砍柴看柴势” ，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用(?不用固定吗？-weibin )。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，
6、再行切片。另者，调高冰冻点。用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。三、冰冻切片的快速染色方法： 切片固定 30 秒1 分钟。 水洗。 染苏木素 35 分钟。 分化。 于碱水中返蓝 20 秒。 伊红染色 1020 秒。 脱水，透明，中性树胶封固。冰冻组织 12 分钟，切片 1 分钟，固定 1
7、 分钟，染色共五分钟。总共在 10 分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用. 常规方法：（1）冰冻切片固定 1030 s（2）稍水洗 1 2 s（3）苏木精液染色（60） 3060 s（4）流水洗去苏木精液 510 s（5） 1%盐酸乙醇 13 s（6）稍水洗 1 2 s（7）促蓝液返蓝 510 s（8）流水冲洗 1530 s（9） 0.5%曙红液染色 3060 s（10）蒸馏水稍洗 12 s（11）80% 乙醇 12 s（12）95% 乙醇 12 s（13）无水乙醇 12 s（14）石炭酸二甲苯 23 s（15）二甲苯（） 23 s（16）二甲苯（） 23 s（17）中性树胶封固。
