1、CircRNA 研究进展分享,分享人：滕飞 部门：癌症业务线-转录组,目录,CircRNA 介绍CircRNA 研究进展CircRNA文章典型案例分析CircRNA目前生物信息分析流程比较CircRNA 未来研究方向预测,1979年洛克菲勒大学的Hsu和Coca-Prados 在电子显微镜下观察到的真核细胞细胞质中观测到环状RNA的存在,CircRNA,circRNAs（Circular RNAs，环形RNA分子）是一类不具有5 末端帽子和3 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子,RNase R,circRNA 具体特征： (1)circRNA由特殊的可变剪切产生，
2、大量存在于真核细胞的细胞质中，但少部分内含子来源的circRNA则存在于核酸内，具有一定的组织、时序和疾病特异性; (2)广泛存在于人体细胞中，有时甚至超过它们线性异构体的10倍之多; (3)与传统的线型RNA(linear RNA，含5和3末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定; (4)具有高度保守性，部分具有快速的进化性改变; (5)大多数来源于外显子，少部分由内含子直接环化形成; (6)部分circRNA分子含miRNA应答元件(miRNAresponse element，MRE)，可充当竞争性内源RNA(competing e
3、ndogenousRNA，ceRNA)，与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平; (7)可以翻译成蛋白质，但大部分是非编码RNA。,CircRNA,分类标准：来源,exon circRNA 定位：细胞质 功能：miRNA海绵作用,CiRNA,EIciRNAs,形成来源,功能：circRNA顺式调控亲本基因的表达,一方面 circRNA可以与RNA结合蛋白相互结合影响亲本基因mRNA的表达。 另一方面，环状RNA形成过程中内含子间竞争性互补配对可以与线性RNA之间达成一种平衡，影响mRNA的表达，甚至蛋白翻译。,功能：海绵
4、作用,miRNA海绵作用（miRNA sponge）：结合并封闭miRNA的调控作用，从而使其靶基因表达增强。,海绵作用来源,功能：编码蛋白质,大多数 circRNA 存在于胞质中,提示它们可以被装载到核糖体而被翻译成多肽。 与许多没有 5帽和 3多聚（ A） 尾的线性 mRNA 相似，circRNA 也缺乏有效的翻译起始结构，但是一旦启动了一个内部核糖体进入位点 （ internal ribosome entry site,IRES） ,两者都是可以被翻译的. 丁型肝炎病毒（ hepatitis D virus,HDV） 的核心包含有单股负链共价闭合 circRNA 分子，它编码的相关蛋白
5、HDV 抗原（ hepatitis D virus antigen,HDAg） 在疾病发展中起到了重要的作用. 另外，研究者发现，人骨肉瘤细胞 U2OS 中，circRNA 具有翻译功能，尽管其翻译效率非常低. 但是，随着越来越多核糖体分析数据的获得，circRNA 在其它细胞类型或物种中是否能被翻译是一个值得深入研究的课题,形成机制,1.“内含子配对驱动环化”（intron-pair-driven circularization）模型， 2.“套索驱动环化”（lariat-driven circularization）模型,Xiao-Ou.Complementary Sequence-Med
6、iated Exon Circularization. Cell, September 18, 2014;DOI: 10.1016/j.cell.2014.09.001,套索驱动环化,哈佛医学院 Salmena 等于 2011 年 7 月提出了着名的 ceRNA 调控假说。 该假说认为： ceRNA 的生物 学 功 能 是 通 过 miRNA 应 答 元 件 （ miRNAresponse element,MRE） 完成的，ceRNA 具有数量和种类不等的 MRE,可以竞争性地结合 miRNA,降低miRNA 对其靶标的抑制作用，也就是 miRNA 的海绵作用。 2012年第一篇环状RNA文章
7、（Salzman，2012）发表，Salzman通过RNA-Seq方法首次报道了80个环状RNA。至此借助于高通量测序技术，环状RNA(circular RNA)验明正身进入科研视界，送出了来自这一环状宇宙的第一份信函 Jeck 等在人类成纤维细胞中检测出了高达 25000 多种的circRNA；而Memczak等通过RNA-seq 数据结合人白细胞数据库鉴定出 1950种人类circRNA、1903种小鼠circRNA (其中81种与人类circRNA相同) 和724种线虫circRNA Circular RNAs are a large class of animal RNAs with
8、regulatory potency.Nature.Year published:(2013)DOI:doi:10.1038/nature11928 2013年Rajewsky教授曾在Nature上发表文章指出，circRNA具有microRNA海绵的作用，可以结合并抑制microRNA的活性，进而调控microRNA靶标发挥作用。atural RNA circles function as efficient microRNA sponges.NatureYear published:(2013)DOI:doi:10.1038/nature11993 2013年9月12日中科院上海生命科学研
9、究院生物化学与细胞生物学研究所陈玲玲组与计算生物所杨力组合作，在Molecular Cell（IF:14.08）上发表 Circular Intronic Long Noncoding RNAs ；构成、细胞定位、成环机制、功能机理 2015年2月的Nature Structural & Molecular Biology（IF:13.30）中国科学技术大学单革实验室报导了其发现的一类新型非编码RNA以及此类非编码RNA的功能机理 Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus 德国Max Delbrck分子医学中
10、心Cell子刊发布环状RNA的表达图谱为人们提供了一个哺乳动物大脑的circRNA表达图谱，证明circRNA在大脑中起到了重要的作用，具有成为生物学指标的价值Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expresse 2017年3月以来Cell Research、Molecular Cell等杂志接连报道了3篇内源性circRNA可以翻译蛋白质的研究,但对翻译的新蛋白生物学功能和分子调控机制仍不清楚。,CircRNA 研究进展,CirlRNA文章典型案例分析,201
11、7年8月29日，中山大学附属第一医院神经外科张弩副教授团队在国际顶级学术期刊美国国家癌症研究所杂志JNCI（Journal of the National Cancer Institute，IF2016 = 12.589）发表题为“Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis”的论文，在国际上首次证实circ-FBXW7可以翻译一种抑制胶质瘤的全新蛋白质，并用功能学实验证明了新蛋白的分子机制，在肿瘤circRNA研究中具有里程碑意义！,重点关注以下三点： 1、如何筛选和确定目标circRNA分子？ 2、如
12、何推测和证实circRNA翻译蛋白质？ 3、如何研究circRNA翻译蛋白质的生物学机制？,研究思路,生物信息学方法： 得到下机数据后，首先将会对其进行过滤，得到HQ Clean Reads。每个样品的 HQ Clean Reads利用Botiwe2和TopHat分别与核糖体序列和参考基因组比对，从比对结果中提取Unmapped Reads，然后截取每一条Unmapped Reads的两端（默认20bp），得到Anchors Reads。用Anchors Reads再一次比对到基因组上，将得到的比对结果提交给find_circ软件鉴定出环状RNA。,比对和筛选结果： 总共发现了31145个ci
13、rcRNAs，其中6442个已经收录在circbase数据库中。大多数circRNAs（18399个）来源与外显子区域，其它来源于内含子，5-UTR, 3-UTR区域或者antisense sequences。绝大多数circRNAs的长度小于1500bp，其中小于500bp的数量最多。癌和癌旁中circRNAs的染色体分布没有明显差异，但是癌组织中circRNA整体表达丰度低于正常组,重点关注以下三点： 1、如何筛选和确定目标circRNA分子？ 2、如何推测和证实circRNA翻译蛋白质？ 3、如何研究circRNA翻译蛋白质的生物学机制？,研究思路,生物信息学方法： 首先，通过上述cir
14、cRNA深度测序及生物信息学分析挖掘edgeR ，发现了一些在脑组织以及癌旁组织中有明显表达差异的circRNAs。其次，作者关注了著名的抑癌基因FBXW7基因的第3、4外显子环化后形成一个620 nt的环状RNA，并命名为circ-FBXW7。最后，作者根据circRNADb在线数据库检索了一下，发现此数据库收录了FBXW7基因对应的一个circRNA跨越基因组长度1227bp的分子，剪接的成熟体circRNA是620nt，有一段编码 185 个氨基酸（amino acid，aa）的开放读码框，在物种间高度保守，暗示着circ-FBXW7可能具备蛋白编码的潜能。综合以上特点，作者将研究目标锁
15、定为circ-FBXW7，是整篇文章的基石,circRNA基因注释,CircRNA文章典型案例分析,对find circ、MapSplice、CIRCexplorer、circRNA finder和CIRI 五个软件进行了对比，找出了各个软件的优劣。,对find circ、MapSplice、CIRCexplorer、circRNA finder和CIRI 五个软件进行了对比，找出了各个软件的优劣。,mapping,比对不上的reads取两头20bp 重新比对,筛选条件 1. GU/AG 在剪接位点的两侧出现 可以检测到清晰的breakpoint 2. 只支持2个mismatch 3. bre
16、akpoint不能再短序列（anchor）以里2 nucleotides 之外的地方出现，也就是最多2nt 4. 至少有两条reads支持这个junction 5.mapping正确的一个短序列的位置要比它mapping到其他位置的分值高35分以上,2. CIRCexplorer这款工具是在2014年随着 Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization 的发布而问世，被誉为2014年RNA测序领域最值得一读的文章之一！2016年新版本CIRCexplorer2,相关文献：1. Xiao-Ou Zhang,Hai-Bin Wang,and
17、 Zhang,Xuhua Lu,Ling-Ling Chen,and Li Yang Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization 2.Zhang, X.O., Dong, R., Zhang, Y., Zhang, J.L., Luo, Z., Zhang, J., Chen, L.L., and Yang, L. (2016). Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Res.CIRC
18、pedia网址：http:/ gene这个思路去检测circRNA。,2. CIRCexplorer这款工具是在2014年随着 Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization 的发布而问世，被誉为2014年RNA测序领域最值得一读的文章之一！2016年新版本CIRCexplorer2,CIRCexplorer2继承了CIRCexplorer主要功能并增加了很多新的特性。它支持TopHat2/TopHat-Fusion, STAR, MapSplice, BWA and segemehl等多种RNA aligners, 并且能够精确地注释
19、预测到环状RNA。更为重要的是，该工具可以侦测到多种环状RNA可变剪切事件，并且能够de nove组装环状RNA全长转录本,CircRNA目前生物信息分析流程比较,建库 测序 生物信息分析,建库,Novogene circRNA建库测序策略,链特异性建库？,建库,数据量,分析流程,Novogene circRNA分析流程,赛吉生物 circRNA分析流程,find_circ,CircRNA 未来研究方向,exon-circRNA miRNA sponge 作用ciRNA 与ElciRNA 对亲本基因顺式调控作用CircRNA 编码蛋白组织间差异表达作为疾病的生物标注物：陈玲玲：没想到短短两年就发现2万多个环形RNA分子，环形RNA对生命体意义重大，至少10%相关基因和许多疾病有关,知识回顾Knowledge Review,
