1、一、实验原理银染是一种重要的 PAGE 染色方法,由于其成本低,所用试剂安全、快速、灵敏度高而被广泛应用。银染的原理是银离子在碱性 pH 环境下被还原成金属银,沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高,可染出凝胶上低于 1 ng/蛋白质点,故广泛的用在 2D 凝胶分析上,及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是一种实验室常用的银染方法,主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测。二、实验试剂1. 乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或 EDTA 钠盐、去离子水、甲醛。三、实验步骤1. 固定量取 100ml 乙醇,25ml 冰醋酸加去离子水到 250ml(视胶板大小
2、情况,适当等比例配制,增加固定液量,以下相同。),使其终浓度达到 40% 乙醇,10% 冰醋酸。将凝胶板浸入固定液中,固定 30min 以上。2. 水洗去离子水浸泡。3x 10 min。2. 致敏生物科研 提醒:量取 75ml 乙醇,17g 乙酸钠或 28.2g 三水乙酸钠,0.5g 硫代硫酸钠加去离子水到体积 250ml。将固定后的凝胶板拿起,浸入致敏液中,浸泡 30 min。4. 水洗去离子水浸泡。3x 10 min。5银染0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛(在使用前加入)加去离子水到终体积250ml。将胶板浸入银染液中,浸泡 30 min。6水洗去离子水浸泡。3x 20
3、 sec。注意把握时间,水洗时间长显色速度慢,点的颜色偏黄色。水洗不充分,背景较深。7显色6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛(在使用前加入)加去离子水到终体积250ml。2-15min,显色时间视凝胶大小、厚薄情况而定。看到各条带,即可将凝胶捞出。8终止3.65g EDTA 钠盐或者 1g 甘氨酸加去离子水到终体积 250ml。浸泡凝胶 10 min。9保存1% 冰醋酸,4 。四、注意事项1银染主要出现在胶的表面,用薄胶(0.5-0.75mm)可以提高灵敏度。2固定时间较长,则加一步水洗 30min,以免胶太脆而破碎。3最好多配制一份显色液,第一次显色到溶液变混浊时换一份显色
4、液,显色到点清晰。4对于考马斯亮蓝染色的胶,可用甲醇将胶漂洗后,继续进行银染。乙酸会干扰银染,因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染,可用Rapid Fix 脱色,并用考马斯亮蓝二次染色。5银染液和显色液需要预冷。6所用器皿要很洁净,不用手直接接触,以免杂蛋白污染。7SDS 凝胶中的巯基乙醇会导致在 60 KDa 或 67 KDa 处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。8染色、水洗等过程中,缓慢的振荡是必要的,一般选择 40-60 rpm。没有设备,用手推轻晃亦可。9凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致,所以全程操作中都应带手套。10凝胶背景呈均一的黑色多是水中
5、的杂质引起的,所以溶液的配制应使用电导率小于 1 S 的去离子水。丙烯酰胺中的杂质也会导致呈现较深的背景。11如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面,可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底,或是染色过程时温度太低。12在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100 和两性电解质这些干扰性物质。13室温操作,温度的波动往往会干扰银染的效果,恒温水浴可以解决这个问题。14当蛋白质中含有核酸或金属时,银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。15据称戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高 40 倍。在染色效果不佳的情况下可以考虑。16银染应尽快照相,随着时间延长,蛋白条带会变浅,而背景会加深。17不同蛋白质对银染反应不一样,尤其是碱性蛋白染色效果差。因此不宜用银染测定不同蛋白的比例。