1、实验四、淀粉酶活性的测定一、实验目的：1、了解 - 淀粉酶和 - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义；2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。二、实验原理：淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是 -淀粉酶和-淀粉酶。根据 -淀粉酶和 -淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在 pH3.6 以下迅速钝化；-淀粉酶不耐热，70 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与 3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的 3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉
2、酶活力（单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量）。三、实验用具：1、实验设备研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，离心机，电磁炉。2、实验材料与试剂（1）0.1mol/l pH5.6 的柠檬酸缓冲液：A 液：称取柠檬酸 20.01g，定容至 1000ml；B 液：称取柠檬酸钠29.41g，定容至 1000ml；取 A 液 55ml 与 B 液 145ml 混匀。（2）1%可溶性淀粉溶液：1g 淀粉溶于 100ml 0.1mol/l pH5.6 的柠檬酸缓冲液；（3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取 3,5-二硝基水杨酸 1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠 30g，
3、定容至 100ml 水中，紧盖瓶塞，勿使 CO2进入；（4）麦芽糖标准溶液：取麦芽糖 0.1g 溶于 100ml 水中；（5）pH 6.8 的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾 6.8g,加水 500ml 使溶解，用 0.1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至6.8，加水稀释至 1000ml 即得。（6）0.4mol/L 的 NaOH 溶液； （7）1%NaCl 溶液。 （8）实验材料：萌发的谷物种子（芽长约 1cm）4、操作步骤1、酶液提取：取 6.0g 浸泡好的原料，去皮后加入 10.0mL 1%的 NaCl 溶液，磨碎后以 2000r/min 离心 10min，转出上清液备用。取上清液 1.
4、0ml，用 pH 为 6.8 的缓冲溶液稀释 5 倍，所得酶液。2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管 4 支,标明 2 支为对照管,2 支为测定管。(2) 于每管中各加酶液 lml ,在 70士 0.5 恒温水浴中准确加热 15min ,取出后迅速用流水冷却。(3) 在对照管中加入 4m1 0.4mol/L 氢氧化钠。 (4) 在 4 支试管中各加入 1ml pH5.6 的柠檬酸缓冲液。(5) 将 4 支试管置另一个 40士 0.5 恒温水浴中保温 15min ,再向各管分别加入 40下预热的 1淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入 40恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入
5、4ml 0.4mol/L 氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖。3、淀粉酶总活力测定:取酶液 5ml,用蒸馏水稀释至 100m1,为稀释酶液。另取 4 支试管编号,2 支为对照,2 支为测定管，然后加入稀释之酶液 lml，在对照管中加入 4m1 0.4mol 氢氧化钠，4 支试管中各加 1ml pH5.6 的柠檬酸缓冲液。以下步骤重复 -淀粉酶测定第（ 5 ）步的操作,同样准备测糖。4、麦芽糖的测定 (1)标准曲线的制作: 取 25ml 刻度试管 7 支,编号.分别加入麦芽糖标准液（ lmg/ml ）0,0.2,0.6, 1.0,1.4,1.8,2.0ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 2.0
6、ml,再各加 3,5 一二硝基水杨酸试剂 2.0m1 ,置沸水浴中加热 10min .取出冷却,用蒸馏水稀释至 25m1。混匀后用分光光度计在 520nm 波长下进行比色,记录吸光度，以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量（ mg ）为横坐标,绘制标准曲线。(2) 样品的测定: 取步骤 2,3 中酶作用后的各管溶液 2m1,分别放入相应的 8 支 25ml 具塞刻度试管中,各加入 2m1 3,5-二硝基水杨酸试剂.以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度平均值,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进行结果计算。五、结果处理 式中 A 为 a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（ mg ）； Ao 为 a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（ mg ）； B 为（a 十 ）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（ mg ）； Bo 为（a 十 ）淀粉酶的对照管中麦芽糖（ mg ）； V T 为样品稀释总体积（ ml ）； V U 为比色时所用样品液体积（ ml ）； W 为样品重（ g ）.本实验规定：40时 5min 内水解淀粉释放 1mg 麦芽糖所需的酶量为 1 个酶活力单位(U)。
