1、转基因鲑鱼,同时具有高产、稳产和抗逆性等优良品质的农作物新品种.,抗虫害的玉米,第二节 基因工程及其应用 ,第六章从杂交育种到基因工程,教学目标,知识技能目标 简述基因工程的基本原理 举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用 情感态度价值观目标 关注转基因生物和转基因食品的安全性简 教学重点难点 述基因工程的基本原理 教学方法手段 类比猜想创设情境 例证法,4,本章，我们主要讨论4个问题： 1. 什么是基因工程基因工程的概念。 2. 为什么能进行基因工程基因工程的原理和技术。 3. 怎样进行基因工程4大步骤 4. 基因工程的应用和前景生产基因工程产品、开展基因治疗等。 5、蛋白质工程,1、概念
2、：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,原 理：,表达水平：,过程：,一、基因工程,基因重组,DNA分子水平,1、定向改造某些性状 2、克服远缘杂交,意义：,培育转基因大肠杆菌的简要过程：,你认为上述培育转基因大肠杆菌的关键步骤有哪些？,普通大肠杆菌 (不能分泌胰岛素),实例展示,培育转基因大肠杆菌的关键步骤：,如:EcoRI,1、该限制酶只能识别GAATTC的序列，说明了限制酶具有的特性是 。,2、 EcoRI限制酶识别了GAATTC的序列后，将会发生什么样的变化？
3、,积极思考,专一性,1.基因的剪刀限制性内切酶,基因操作(gene engineering)的工具,模型构建1,练习使用EcoRI 剪切目的基因,黏性末端,（2006.台州质检）下列是由限制酶切割形成的DNA片段，能用相应DNA连接酶将它们恢复连接的组合是,CTGCA G,G,CTTAA, G,ACGTC, AATTC,G,A. ； B. ； C. ； D.以上都不对,A,2.分子针线DNA连接酶 (DNA linking-enzyme),积极思考,DNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)分子的什么部位？,基因操作(gene engineering)的工具,
4、模型构建2,使用DNA连接酶制作重组DNA分子,甲片段,重组DNA分子 Recombinant DNA,1.(双选)如图,下列有关酶功能的叙述中,正确的是,A.切断a处的酶为限制酶 B.连接a处的酶为RNA聚合酶 C.切断b处的酶为解旋酶 D.连接b处的酶为DNA连接酶,小试身手,DNA连接酶的作用是：,A.子链和母链之间形成氢键 B.黏性末端之间形成氢键 C.两个DNA末端间的缝隙连接 D.A、B、C都对,C,3、基因的运载体 作用： 将外源基因送入受体细胞。 条件： 能在宿主细胞内复制并稳定地保存。 具有多个限制酶切点以便 与外源基因相连。 具有某些标记基因，便于进行筛选 种类：质粒、噬菌
5、体和动植物病毒。,3、基因的运输工具运载体,标记基因，便于进行检测。,质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。,三、基因工程的操作步骤,从细胞中分离出DNA,从大肠杆菌中提取质粒,提取目的基因,目的基因与运载体结合,DNA连 接酶,目的基因导入受体细胞,目的基因的表达与检测,基因工程操作的基本步骤,基因工程(gene engineering)的“四步曲”,提取目的基因,1,目的基因与运载体结合,2,将目的基因导入受体细胞,3,目的基因的检测和表达,4,步骤一：目的基因的获取,1、什么是目的基因？,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法有哪
6、些?,（1）直接从供体细胞中分离基因（鸟枪法）,（2）人工合成基因（反转录法、直接合成法）,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。,直接分离基因鸟枪法,将供体细胞中的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到不同的受体细胞中去，让这些DNA片段在受体细胞中扩增。从中找出含有目的基因细胞，并将含有目的基因的DNA片段分离出来。 该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大。一般不适用于真核细胞的基因。,人工合成基因法,DNA合成仪,直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧
7、核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。,反转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR技术扩增目的基因,反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,杂交双链 (单链RN
8、A/单链DNA),单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组DNA分子。,步骤二：目的基因与运载体结合,三、基因工程的操作步骤,目的基因与运载体结合的结果可能有三种情况：目的基因与目的基因结合，质粒与质粒结合，目的基因与质粒结合。所以需要筛选。,作用：将外源基因送入 受体细胞,(基因表达载体的构建）,常用的受体细胞：,步骤三：目的基因导入受体细胞,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,主要借鉴细菌或病毒
9、侵然细胞的途径,导入方式：,三、基因工程的操作步骤,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌介导法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收DNA分子,(氯化钙法),（三）将目的基因导入受体细胞,花粉管通道法,花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。,主要原理是授粉后使外源 DNA 能沿着花粉管通道形成的途径渗透，经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备正常细胞壁的合子或早期
10、胚胎细胞。这一技术原理可以应用于任何开花植物,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达,1.农杆菌：农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位 ，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。,农杆菌介导法,2.转化：,只有很少部分的细胞符合这样的要求，大多数会因为力道不对而失败，但这少部分细胞已足够完成基因转移操作的需要。利用氦气、
11、金粉的原因主要是: 四密度大，穿孔容易; 口活性小，不易毒害细胞。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用较低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。,显微注射法,显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5m）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。,这种显微注射术的程序，需有相当精密的显微操作设备，制造长管尖时，需用微量吸管拉长器（，注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均
12、可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞 细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.常用菌：,（以增大细菌细胞壁的通透性）,氯化钙法：,大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,三、
13、基因工程的操作步骤,步骤四：目的基因的检测和表达,检测：通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入。,表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。,检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,基因探针,非目的基因片段,基因探针,目的基因片段,基因探针,目的基因片段,基因探针,目的基因的表达和检测,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）
14、、显微注射法（动物） 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译,exercise,基因工程的正确操作步骤是:,使目的基因与运载体结合 将目的基因导入受体细胞 检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 提取目的基因, B. C. D. ,小试身手,要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶是( ) 限制酶 连接酶 解旋酶 还原酶 ,A,过程： 1、重组药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子 2、用显微注射法导入到受精卵 3、将受精卵送入母体生长发育 4、转基因动物进入泌乳期后，提取乳汁,转基因抗虫棉花,转入苏云金杆菌的一个抗虫基因，是中国目前最主要的转基因作物,四、 基因工程的应用,1、基因工
15、程与作物育种,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯,不会引起过敏的转基因大豆,运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国),导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠,导入人基因具特殊用途的猪和小鼠,超级动物,特殊动物,我国生产的部分基因 工程疫苗和药物, 基因工程药品的生产,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导
16、入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,2、基因工程在医学上的应用,胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!,通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取204mg干扰素。,干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。,其它基因工程药物,人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，
17、均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。,人造血液及其生产,基因诊断DNA探针,概念：是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测，是基因诊断最基本的技术之一。条件：（1）必须是单链；（2）带有容易被检测出来的标记物。原理：DNA分子杂交（碱基互补配对）,基因诊断生物芯片,从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平
18、行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,基因治疗用正常的基因取代或修补病人细胞中有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的, 环境监测： 基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。,1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来,3、基因工程与环境保护,利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。, 环境污染治理： 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化
19、汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,课,究,探,后,课题：利用网络资源并结合教材中的资料分析,就“转基因生物和转基因食品的安全性”以小论文的形式发表个人见解。,几种常见育种方法的比较,作业：,杂交自交选优,基因重组,不同个体的优良性状可集中到同一个个体上,育种时间长，需及时发现优良性状,杂交水稻 中国荷斯坦牛,花药离体培养、秋水仙素诱导加倍,染色体变异,明显缩短育种年限，后代一般都为纯种,技术复杂，成本高,普通小麦花药离体培养,秋水仙素处理萌发的种子、幼苗,染色体变异,植物茎杆粗壮，果实、种子大，营养高,发育延迟，结实率低,无籽西瓜,物理或化学方法处理动植物 、微生物,基因突变,提高变异频
20、率，大幅度改良某些性状，加速育种进程,有利变异少，需要处理大量实验材料，具有不确定性,青霉菌高产菌株的培育 黑农五号大豆,基因重组,将一种生物特定基因转移到另一种生物体内,染色体变异定向地改造生物的遗传性状,可能引起生态危机，技术难度大,转基因抗虫棉,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落),启动子：位于基因首端一段能与R
21、NA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,在遗传信息的表达过程中起着调控作用,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,编码区,RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子（但能转录为mRNA，转录后剪切掉）,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的基因结构,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：在遗传信息的表达过程中起着调控作用,原核细胞与真核细胞基因结构比较：,非编码区,非编码区,编码区,都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成,编码区是连续的,编码区是间隔的，不连续的,外显子,内含子,启动子,终止子,
