1、2016.8.11 刘亭,报告内容,基因编辑简介 CRISPR/Cas9 (2013，第三代基因编辑技术，目前最靠谱) NgAgo-gDNA（2016，第四代基因编辑技术，还不靠谱？） TELEN（2011，第二代基因编辑技术） ZFN （2001，第一代基因编辑技术） 四代基因编辑技术的比较 基因编辑技术的其它应用,基因编辑,概念 对基因组进行人工定点修饰，包括敲除、敲减、插入、修正目的基因 意义 证明基因功能不可缺少的逻辑环节 基因工程和基因治疗的重要手段 技术 Suicide plasmid，RNAi，ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9，NgAgo-gDNA,细菌的获得性免疫系统
2、CRISPR/Cas9,产脓链球菌（SF370）,DNA,剪切,入侵的病毒或质粒 DNA不能复制和整合,剪切,基因编辑工具CRISPR/Cas9,CCR5基因突变,Cas9剪断的基因,研究思路,Cas9很牛，但是也有弱点，如脱靶，gRNA 发卡等，有没有比它还牛的？ Argonautes有牛过Cas9 的潜力，来源广泛，几乎所有生物中都有，不像Cas9只存在原核生物里。某些Argonautes 可直接结合ssDNA在其引导下切割靶DNA，不像Cas9 需要gRNA-trancrRNA的二级结构才能结合gRNA发挥作用。Cas 9只能识别切割PAM域处的序列， Argonautes 没有这个限制
3、。 TtAgo和PfAgo可体外结合5磷酸化 ssDNA切割与它有互补序列的靶DNA ，但是反应温度是65，限制了其在细胞体内的应用。 有没有其它同胞可以在37 左右其作用呢？NCBI blast找，找到一个候选的Ng-Ago。是嗜盐碱杆菌中的一个基因。 理想的Argonautes 就是要有自己的个性，与Cas 9不同，如上所述，结合DNA而不是RNA，同时能有Cas9 一样的功能，体内体外都能编辑基因，不断能敲除还能敲入，并且是在37 左右。最好比cas9 更牛，不需要PAM，效率高并且不容易脱靶。,Figure 1 NgAgo uses 5 phosphorylated ssDNA gui
4、des and cleaves DNA targets in vitro.,Figure 2 NgAgo binds ssDNA guide in a oneguide-faithful manner.,Figure 3 NgAgo works as an endonuclease and can cleave DNA targets in vivo.,Figure 4 NgAgo can make targeted double-strand breaks in mammalian genome.,Figure 5 NgAgo can be used to edit mammalian ge
5、nome.,NgAgo-gDNA系统优势,1.容错率低，错配一个碱基就明显影响了NgAgo的效率，而错配三个就不起作用了； 2.5-p-ssDNA在哺乳动物内稀少，这也就决定了胞内不会有gDNA带着NgAgo乱搞； 3.NgAgo一旦与5-p-ssDNA结合就不会再与其他的5-p-ssDNA结合； 以上三条都是讲NgAgo脱靶效应低； 4.ssDNAs易于设计和合成，因为它不依赖于PAM序列，比较容易推广应用。,TALEN（transcription activator-like effector nuclease）转录激活样效应因子核酸酶,TALEN基因敲除基本流程确定靶点,1 选择目标基因
6、外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点,TALEN基因敲除基本流程载体构建,2.1 TAL靶点识别域的克隆构建,TALEN基因敲除基本流程载体构建,2.2 将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体,TALEN基因敲除基本流程转化敲除基因,3 将重组真核表达质粒转入（卵）细胞以表达重组核酸酶，敲除基因,TALEN基因敲除基本流程筛选突变体,4. 筛选突变体,锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）技术,第一到第四代基因编辑技术的比较,NgAgo-gDNA NgAgo-gDNA gDNA脱氧核糖核苷酸 Ago蛋白 多位点编辑 20bp 双链断裂；单链缺
7、刻 非常容易 ？ 较轻？,CRISPR/Cas9技术应用不只是基因编辑,转录调控，表观修饰等,TALE技术应用不只是敲除,靶向基因敲除，敲入，转录调控，表观修饰,CRISPR/Cas9研究历史,1987年，日本科学家在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列。 随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，正式将其命名为CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)成簇的规律间隔的短回文重复序列。 2005年西班牙科学家发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传
8、物质（如噬菌体基因组序列）高度同源，推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵。 2007年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR系统抵抗噬菌体入侵；2008年，Marraffini 等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能。 2012-2014年：Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier解释了CRISPR/Cas9系统的工作原理。理论上指向了一种全新的基因组编辑技术。 2013年初，麻省理工学院博德研究所的张锋首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T 细胞EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞Th基因实现了定点突变。同年哈佛大学医学院的乔治切奇（George Church）利用CRISPR/Cas9在人293T细胞和K652细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定点插入。,
