1、western blot与蛋白质双向电泳的原理，方法及应用,演示人：胡祺祥，张锋，余涵,western blot原理及方法,1,蛋白质双向电泳原理及方法,2,医学应用,3,Contents,目,录,第,1,章,western blot原理及方法,一.基本原理,通过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，以固相载体上的这些蛋白质或者多肽作为抗原与对应的抗体起免疫反应再与酶或者同位素标记的第二抗体起作用，通过底物显色或者放射自显影来检测特定基因表达的蛋白质,PAGE分离蛋白质,印迹转移,底物显色或者放射自显影,一抗，二抗杂交,二.具体的方法和步骤,I .蛋白质样品制备,1
2、.向细胞悬液中加入蛋白酶抑制剂 2.细胞裂解液破碎细胞（原理是表面活性剂的两亲性） 3.水溶液或者有机溶剂提取（后者适用于非极性侧链多的蛋白） 4.层析或者电洗脱制备目的蛋白,II.SDSPAGE电泳,问：什么决定了蛋白质能走多远？,首先明白：决定蛋白质运动快慢的是蛋白质带电量和蛋白质的质量 那么：此处是什么起决定作用?,SDS所带电荷极多,蛋白质电荷相比之下可以忽略,按体重分电荷,III .转膜,转膜两种方法 1.半干法：,2.湿法,注意事项：,IV .封闭,封闭是什么?为什要要进行封闭？,V .杂交,问：什么是一抗，二抗？ 一抗是指对待测蛋白有免疫反应的抗体 二抗是指对一抗有免疫反应的抗体
3、（把一抗当做抗原）问：为什么要进行两次免疫反应? 1.信号放大，因为一抗可以结合多个二抗 2.价格便宜，一种二抗可以对多种一抗起作用，只需要找到可以使用的二抗即可 3.可以有较多的选择，而且，带标记的二抗可以直接购买缺点：二次免疫导致的非特异性条带可能影响结果,VI.显色,第,2,章,蛋白质双向电泳,实验原理,第一向：等点聚焦电泳 （IEF，isoelectric focusing）,第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,等电聚焦电泳,在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不
4、同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,在聚丙烯凝胶中加入阴离子去污剂SDS，SDS将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开使蛋白质变性，且包裹在变性蛋白表面。SDS带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。不同蛋白质分子的迁移率主要决定于其带有的SDS量，即蛋白质分子的大小。电泳中，不同的蛋白质根据其分子大小移动到不同位置，小分子较大分子移动快。,PAAG是丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂按一定比例混合，在催化剂（如过硫酸铵）作用下聚合而成的交叉网状结构的凝胶，使其产生分子筛效应。以此凝胶为支持物的电泳为PAGE,实验方法与步
5、骤,样品制备 IPG胶条上样 第一向等电聚焦 IPG胶条平衡 第二向SDS-PAGE 凝胶的染色 图像处理分析,样品制备,双向电泳的最关键步骤之一原则：尽可能多地提取总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，防止样品提取过程中的化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质增加样品溶解性的方法： 变性剂，使蛋白质的疏水基团暴露，降低接近疏水残 基的能量域。如尿素、硫脲等 表面活性剂，可溶解疏水基团，如离子去污剂SDS，非离子去污剂NP-40及两性离子去污剂CHAPS，其中CHAPS最好 还原剂，可使蛋白质展开更完全，溶解更彻底,预处理细胞 （清洗等）,除杂质,溶解,破碎细胞,沉淀蛋白质,IPG胶条上样与第一
6、向等点聚焦,将样品与水化上样缓冲液混合，体积比约为1:4,混合物加入胶条槽,除去保护膜，将胶条酸性端（尖端）朝胶条槽阳极方向放入，慢慢下压，最后放入碱性端（平端），使溶液浸湿胶条，避免生成气泡,在胶条上覆盖适量矿物油，盖上盖,将胶条槽平放在电泳仪上，对好正负极，设定等电聚焦程序,IPG胶条平衡,聚焦结束的胶条应立即进行平衡,将胶条放入平衡缓冲液中，振荡15分钟 将胶条放入平衡缓冲液中，振荡15分钟 用去离子水润洗胶条1秒，用滤纸在胶条边缘吸去多余水分,平衡缓冲液：-含DTT（二硫苏糖醇）-使变性的非烷基化蛋白质处于还原状态平衡缓冲液：-含碘乙酰胺-使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化,
7、第二向SDS-PAGE,胶条染色,硝酸银染色 优点：灵敏度高 缺点：重复性低，质谱兼容性低考马斯亮兰染色 优点：重复性高，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低荧光染色 优点：重复性高，质谱兼容性高，灵敏度高 缺点：价格贵,硝酸银染色,考马斯亮兰染色,荧光染色,图像处理分析流程,凝胶图像扫描 图像加工 斑点检查与定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立,第,3,章,医学应用,01,过敏原检测及方法建立,02,诊断寄生虫病,03,检测基因产物表达及水平,04,检测病毒感染,western blot的临床应用,由于许多过敏原是来着生物体的机体，尤其表现在蛋白质上。 例如鱼类。鱼类是最常
8、见的易引起过敏反应的食物，而小清蛋白是最常见的过敏原。在建立鱼小清蛋白检测及方法建立过程中利用western blot法完成免疫鉴定，为低免疫产品研制生产提供理论依据。,过敏原检测及方法建立,利用western blot法进行寄生虫病检测一般从寄生虫特异抗原入手，检测人体液内相关蛋白的含量，以确定是否感染寄生虫病。 优点是特异性强，始于用于疑似病人的诊断，但是由于费用高昂，费时且技术要求高所以建议做推广但不建议普及。一般检测常用ELISA检测。 应用病例： 诊断囊虫病：运用DN A重组技术,构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库,以囊虫病患者血清及病猪血清为抗体,从中筛选出4个特异性抗原（cC1
9、、cC2、cP1、cH1）,这些抗原克隆经IPTG诱导,形成-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白( fusion protein, FP)。 诊断人颚口线虫病：采用Western印迹技术检测颚口线虫特异的相对分子质量为21 000和24 000抗原蛋白条带，结果 Western印迹法检测颚口线虫患者血清,均可见相对分子质量为24 000的条带,7份可见相对分子质量为21 000的条带。,诊断寄生虫病,利用western blot检测基因产物的表达水平一般应用于肿瘤，糖尿病的由于机体自身病变的疾病诊断中。 应用病例： 成人隐匿型糖尿病：通过免疫印迹四联检测试剂条对319例2型糖尿病患者进行
10、糖尿病自身抗体谷氨酸脱羧酶抗体（GAD）、胰岛细胞抗体（ICA）、胰岛素抗体（IAA）、酪氨酸磷酸化酶自身抗体（IA2）检测，显著高于单一抗体检测。结论检测血清GAD、IA2、IAA、ICA能够为LADA的早期诊断提供依据，同时更好地进行病情评估和治疗方案的调整。 胃癌诊断：采用免疫印迹检测NOTUM蛋白及-catenin蛋白的表达量,使用SPSS进行相关性分析确定NOTUM蛋白与-catenin蛋白之间的关系，确定胃癌发展情况。,检测基因产物表达及水平,检测病毒感染有两个应用方向：疾病诊断与血液筛选。 疾病诊断例：风疹病毒() 能够引起先天感染。通过孕妇传播,致使胎儿先天畸形或导致先天性风疹
11、综合征如先天性心脏病、智力低下等。因此能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质 、预防后天及再感染具有重要意义。目前临床上所用的ELISA 检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制抗原 , 特异度低、灵敏度差,缺乏统一的抗原标准。现可采用Western-blot的方法,测定风疹病毒的主要抗原性蛋白, 以指导临床应用 。,检测病毒感染,01,双向电泳技术(2-DE),02,计算机图像分析与大规模数据处理技术,03,质谱技术,蛋白质双向电泳应用,双向电泳技术(2-DE)在蛋白质组学中发挥着重要的作用,可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。,作用,1双向电泳技术在病
12、原微生物蛋白质组研究中的进展,双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中发挥着重要作用，可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质问相互作用、蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。,01,02,通过双向电泳技术分析对培养基和细胞内生长的细菌进行比较，发现感染巨噬细胞的军团菌、布鲁氏菌、沙门氏菌中分别有一些特殊蛋白被诱导或被阻遏。,蛋白质组学双向电泳技术可作为致病微生物临床隔离群区分的可靠参数之一。在对流感嗜血杆菌研究中发现，实验室培养的和临床分离的遗传背景相同的菌株出现了新的ORF，对临床分离株NCT
13、C8143进行双向电泳，发现色氨酸酶的含量较高，而实验室培养的菌株中则没有色氨酸酶。,双向电泳技术在病原微生物致病机理研究中的应用,双向电泳技术在病原微生物药物抗性基因功能研究中的应用 双向电泳技术可以进行微生物抗性机理的研究。 Diffes等对Divercin V4l抗性和野生型的产单核细胞 李斯特氏菌进行2-DE分析，发现至少在17个蛋白质存在差异，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9个蛋白质，而新增8个蛋白质，其中只有1个Rl是存在于已知该菌的数据库中，为鞭毛蛋白；机会致病真菌如念珠菌属产生了许多的耐药菌株。 伊曲康唑类化合物通过抑制真菌细胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且对耐真菌药物的菌株
14、起作用。Bruneau等对比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3种杀真菌药处理所产生的白色念珠菌双向电泳差异蛋白质图谱后认为，氟康唑和伊曲康唑在蛋白质组水平具有共同的作用机制。 因此，病原微生物的耐药菌株和敏感菌株的双向电泳研究，对阐明耐药相关机制、鉴定新的药物靶位和耐药诊断标志有非常重要的价值。,人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供理论依据等方面都取得了一些重要的进展。肿瘤发生的早期常常无任何症状，而只有在转移时才容易被发现，这往往导致延误了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期的标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重要。,2.双向电泳技术在人类恶性肿瘤研究中的进展,双向电泳技术的出现，为动态、高通量的研究药物作用机制提供了强有力的方法支持。 双向电泳技术的另一应用就是研究药物的毒理作用。比较正常细胞与药物处理后细胞的蛋白质表达丰度变化，可以提示药物的毒性作用机制。细胞在施药之后的代谢反应做出实时的检测，不仅能确定疗效，也能针对毒性代谢物质的发现而对药物进行直接的改良，是一项意义深远的发现。,3.双向电泳技术在药物作用机制研究的进展,THANKS,LOREM IPSUM,
