1、动物肝脏DNA的制备和鉴定,甘肃中医药大学,核酸的分类,DNA (脱氧核糖核酸)主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA（核糖核酸）存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,核酸的理化性质,在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在,微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂,在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小,在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来,浓盐法
2、：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。 离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。,基因组DNA的提取方法,核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。去垢剂的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3对RN
3、ase、DNase有一定的抑制作用。,如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠,作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。,如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,核酸制备中常用的蛋白质变性剂,核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNARNase：降解RNA蛋白酶K：降解蛋白质溶菌酶：破碎细胞,核酸提取的主要步骤,沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质,除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤,
4、除去其它不需要的核酸分子,破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶）,注意事项,加入RNA降解酶除RNA,加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等,蛋白变性剂反应不宜过于剧烈,避免过酸、过碱及高温,一、实验目的：,1、学习并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及其原理。2、学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法。,二、实验原理,核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示。DNA-Pro（DNP）细胞核RNA-Pro(RNP)核仁及细胞质,溶于高盐溶液（1mol/L）,微溶于低盐溶液（0.14mol/L）溶于
5、低盐溶液（0.14mol/L）微溶于高盐溶液（1mol/L）,核酸含量的测定方法：紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成-羟基-酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收 。DNA20400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。,三、实验试剂,95%冷乙醇、NaCl固体,二苯胺：称取纯二苯胺1g溶于100ml冰醋酸中，加入10ml过氯酸，混匀。临用时加1ml1.6%乙醛溶液，所配置试剂应为无色。,0.14molL NaCl0.05molL 柠檬酸钠缓冲液(PH
6、=6.8),DNA标准液200ug/ml:DNA钠盐用5mmol/L的NaOH配制。,氯仿/异戊醇=20：1（V/V）,5% SDS,组织捣碎匀浆机,除去蛋白质的方法,SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA,防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性,氯仿一异成醇使蛋白质变性，离心除去变性蛋白质,DNA的定量测定,DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml，作为待测品。,混匀，60水浴保温45min，冷却后，595nm处，比色。,以吸光度A595nm对DNA含量（ug）作图， 绘制标准曲线。 从标准曲线上查出样品的DNA含量。 计算100g猪肝中DNA的含量：待测样品中DNA的质量25(稀释倍数)称取猪肝的质量,=,匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。 固体NaCl应磨碎，加入应分批缓慢加入，边加边摇，避免局部浓度过大或者未及溶解而沉入氯仿层。 变性蛋白质层易散，吸取上清液时应仔细，不要将蛋白质及下层的氯仿吸入。 实验结束后将变性的蛋白质（肝糜）小心取出置于专用的废物袋中，氯仿倒入回收瓶内。,注意事项,THANK YOU,
