1、秀丽隐杆线虫中 RNA 干扰作用的遗传分析姓名 摘要：秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。RNA 干扰（RNAi）是一种由双链 RNA 引起的转录后水平的基因沉默（PTGS ）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。本次实验 通过饲喂的方法，观察外源 RNA 分子对秀丽隐杆线虫发育的影响，从而了解 RNA 干扰的原理、特性及其应用。通过此次实验，我们达到了实验目的，取得了良好的实验效果。关键词：秀丽隐杆线虫、RNA 干扰 （RNAi） 、饲喂法1引言秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。在理想的条件下（充足食物，20 ）生命周期大约为 4d。秀丽隐杆线虫成体长
2、11.5mm，体宽约 70m，全身透明，以细菌为食，全身共有 959 个细胞。研究用的通常是秀丽隐杆线虫野生型（N2） 。从 1965 年开始，Sydney Brenner 以线虫为材料研究发育和神经生物学，现在已经成为经典模式生物之一。线虫性别是由常染色体和性染色体组的比例决定，有两种性别形式：雌雄同体和雄虫。雌雄同体的性染色体为 XX，而雄虫性染色体为 X0。雌雄同体的秀丽隐杆线虫既产生卵，又产生精子，可以与雄体交配，也可以自体受精进行繁殖，但雌雄同体之间不能异体受精。在雌雄同体自交繁殖中以 0.2%的频率产生雄体（是减数分裂时性染色体不分开造成的） ；而雄体与雌雄同体交配其后代两种性别比
3、例为 1:1。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated ，Unc ） 、短胖（dumpy ，Dpy） 、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系。秀丽隐杆线虫的生命周期很短，20仅需 4d。卵在通过受精囊时受精形成一层坚硬的几丁质的外壳，在母体内就开始分裂。从母体产出的卵大约处于 30 个细胞期。胚胎发生很有规律，从卵中孵化出约有 550 个细胞的幼虫。从孵化到成体，线虫经历 4 个幼虫阶段（L1L4）和 4
4、 次蜕皮，在身体大小和细胞数目两方面都有增长。蜕皮的时间（20 ）分别是孵化后 13、21.5 、29.5 和 41h；身体长度分别是 350、470、640 和 890m。秀丽隐杆线虫孵化后约 50h 开始产卵，每个雌雄同体可产 200 到 300 卵。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链 RNA 引起的转录后水平的基因沉默（PTGS ）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。目前，在线虫中发展出 3 种不同的 RNAi 实验操作方法： 注射（injection ）dsRNA； 将线虫浸泡（soaking）于一定浓度的 dsRNA 溶液中； 用表达 d
5、sRNA 的工程菌（E.coli）饲养（ feeding）线虫。这 3 种方法各有优缺点，其中饲养法简单易行，适合高通量的基因功能筛选研究，已有用此方法对线虫全基因组进行筛选的报道。此次实验培养出 RNAi 型秀丽隐杆线虫的整体步骤是：提取秀丽隐杆线虫总 RNA 反转录合成 cDNA，cDNA 经过 RT-PCR 产生 Gene，Gene 经过双酶切产生 Gene 片段。另外L4440 质粒双酶切形成线性 L4440 质粒。Gene 片段与线性 L4440 质粒经过 T4 DNA 连接酶连接形成 L4440 质粒-Gene，L4440 质粒-Gene 转入到 E.coli HT115（DE3）
6、中进行阳性克隆。阳性克隆后进行 PCR 鉴定。之后将阳性克隆产物进行 IPTG 诱导形成 Gene-dsRNA，将其通过饲喂法导入到秀丽隐杆线虫，能产生对目的基因表达和功能的特异性干扰，从而培养出RNAi 型秀丽隐杆线虫。2材料和方法2.1 材料、试剂和器材实验材料：秀丽隐杆线虫野生型（N2） 、大肠杆菌 OP50、大肠杆菌 HT115（DE3 ） 、6种不同的 RNA 干扰菌株 HT115（含有能表达不同 gene dsRNA 的质粒，对应的性状编号分别为：bli-2 、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon）实验试剂：LB 液体培养基、NGM 固体培养基实验器材：实体显微镜、显
7、微镜、粘虫器（pick） 、培养皿、锥形瓶、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、记号笔、酒精灯、火柴、高压蒸汽灭菌锅、封口膜2.2 方法2.2.1 活化大肠杆菌 OP50打开超净工作台的紫外灯 5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取一个灭菌后的15mL 离心管，用微量移液器向其加入 3mL LB 液体培养基，再向其中加入 300L 大肠杆菌OP50。将 15mL 离心管放入 37恒温摇床中振荡培养过夜（ 812h） 。2.2.2 大肠杆菌 OP50 涂平板大肠杆菌 OP50 振荡培养过夜后，打开超净工作台的紫外灯 5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。用微量移液器取 200L 菌液加入到 N
8、GM 培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口。将接种后的平板置于 37 恒温培养箱中培养 67 小时。2.2.3 向 NGM 培养基平板中接种线虫从老师提供的线虫培养板中选取有卵的或者 L1、L2 期雌雄同体线虫（生长时期保证一致） ，用粘虫器（pick）挑取这些线虫接种到 NGM 培养基平板中，用封口膜将平板封口。记录接种的线虫所处的生长时期和接种时间，根据线虫生长时期与温度的关系与自己的实际时间情况合理确定线虫培养方案，选择在不同温度的恒温培养箱（20和 25）中的培养时间，将线虫培养至第四幼虫期（L4 期线虫） 。2.2.4 活化干扰菌株和涂干扰板在步骤 2.2.3 进
9、行的期间，要进行活化干扰菌株和涂干扰板。打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取 7 个灭菌后的 15mL 离心管，用微量移液器向其中加入 3mL LB 液体培养基和 3L Amp，再分别加入 300Lbli-2、dpy-2 、dpy-5、him、sma-2和 lon6 种干扰菌株以及阴性对照 HT115 菌株，用微量移液器吹吸混匀。将这 7 个 15mL 离心管做好标记，放入 37恒温摇床中振荡培养过夜（1216h） 。之后取 7 个 NGM 培养基平板，在超净工作台中，用微量移液器分别取 200300L 7 种活化好的菌液加入到 NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液
10、散开，用封口膜将平板封口，在平板的皿底和皿盖上同时做好标记。将干扰板置于 37恒温培养箱中培养 616 小时。此步骤要求这 7 个干扰板接种的菌株培养好的时间与步骤 2.2.3 中将线虫培养至第四幼虫期（L4 期线虫）的时间一致。2.2.5 向 7 个干扰板中挑取 L4 期线虫步骤 2.2.4 中 7 个干扰板接种的菌株培养好后，步骤 2.2.3 中的线虫也培养至第四幼虫期（L4 期线虫） 。此时用粘虫器（pick）分别向 7 个干扰板中挑取 10 条 L4 期雌雄同体线虫，用封口膜将平板封口。挑取线虫后将干扰板置于 20恒温培养箱中培养 2d。2.2.6 挑取 4 5 条 L4 期雌雄同体线
11、虫到新的干扰板中2d 后挑取 45 条 L4 期雌雄同体线虫到新的干扰板中，用封口膜将平板封口。与原干扰板共同置于 20恒温培养箱中培养 5d。2.2.7 观察两个干扰板中的后代表型，统计突变型出现的频率3结果此次实验中使用了 6 种不同的 RNA 干扰菌株 HT115（含有能表达不同 gene dsRNA 的质粒） ，对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him 、sma-2 、lon 。同时还使用了起阴性对照作用的 RNA 干扰菌株 HT115，即转入了 RNA 干扰质粒空载体 L4440 的 HT115。（1 ）接种了 RNA 干扰菌株 HT115 的平板起阴性对照的
12、作用，线虫不发生突变。如图一所示。图一 阴性对照的平板中线虫不发生突变图一中的线虫都是雌雄同体线虫，个体比雄虫稍大，产卵器位于身体的中部，体内可见卵或胚胎。图二是在 10低倍镜下观察的 HT115 阴性对照线虫。图二 10低倍镜下观察的 HT115 阴性对照线虫（2 ）接种了 bli-2 干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫身上表皮起泡（尤其是头部） ，线虫比野生型稍小。如图三所示。图三 接种 bli-2 干扰菌株的干扰板中突变线虫图三中可以很明显地观察到突变线虫头部表皮起泡。（3 ）接种了 dpy-2 干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫粗短，身体向左
13、转弯，身体僵硬，幼虫正常。如图四所示。图四 接种 dpy-2 干扰菌株的干扰板中突变线虫图四中可以很明显地观察到突变线虫粗短，身体向左转弯，身体僵硬。（4 ）接种了 dpy-5 干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫非常粗短，幼虫正常。如图五所示。图五 接种 dpy-5 干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫A B图五中“A”是突变线虫， “B”是未突变线虫（即野生型线虫） 。二者对比可以很明显地看出突变性状。图六是在 10低倍镜下观察接种 dpy-5 干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫。A图六 10低倍镜下接种 dpy-5 干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫BC图六
14、中“A”是未突变线虫（即野生型线虫） ， “B”和“C”是突变线虫。二者对比可以很明显地看出突变性状。（5 ）接种了 him 干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是在干扰板中雄虫出现率提高。如图七所示。ABC DE图七 接种 him 干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫图七中“A”和“B ”是雄虫， “C”、 “D”和“E”是雌雄同体线虫。雄虫比雌雄同体线虫身体细、颜色浅，尾部的交配器呈扇形（三角形） 。不过虽然接种了 him 干扰菌株的干扰板中雄虫出现率提高，但是雄虫出现的频率仍然较低。图八是在 10低倍镜下观察接种 him 干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫。图八 10低倍
15、镜下观察接种 him 干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫ABCD图八中“A”是雄虫， “B”、 “C”和“D”是雌雄同体线虫。图中可以很明显地看出雄虫比雌雄同体线虫身体细、颜色浅，尾部的交配器由于被雌雄同体线虫挡住无法观察到扇形（三角形） 。还可以看到雄虫体内的消化管和储精管。（6 ）接种了 sma-2 干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是线虫比野生型短小。如图九所示。图九 接种 sma-2 干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫AB实验中发现，突变线虫比野生型线虫短小的性状并不明显，较难观察。图九中“A”（突变线虫）和“B” （未突变线虫）两只线虫对比可以较清楚地观察出突变
16、性状。（7 ）接种了 lon 干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是线虫各个发育阶段均较野生型长，头部和尾部变尖。如图十所示。图十 接种 lon 干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫AB实验中发现，突变线虫比野生型线虫长的性状并不明显，较难观察。图十中“A” （突变线虫）和“B” （未突变线虫）两只线虫对比可以较清楚地观察出突变性状。图十一是在 10低倍镜下观察接种 lon 干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫。图十一 10低倍镜下观察接种 lon 干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫ABC实验中发现，突变线虫比野生型线虫长的性状并不明显，较难观察。图十一中“A”（突变线虫
17、）和“B” 、 “C”（未突变线虫）的对比可以较清楚地观察出突变性状。4讨论RNAi 是一个奇特的生物现象，在许多物种中特殊的 dsRNA 的表达会导致相应的 mRNA降解使得该基因的功能几乎完全丧失。应用这项技术可以方便的找出突变的表型而不必去费力的分离一个突变的基因本从而大大加快了研究的进程。RNA 干扰机制是如下所示：第一步（起始阶段） ，dsRNA 在内切核酸酶（Dicer 酶）作用下加工裂解形成 2123nt 的 siRNA；第二步（效应阶段） ，是由 siRNA 中的反义链指导形成 RNA 诱导的沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC） ，
18、由 RISC 介导切割靶向mRNA 分子中与 siRNA 互补的区域，从而达到干扰基因表达的作用。秀丽隐杆线虫的 RNAi 方法有显微注射法、浸泡法和饲喂法。显微注射法是最初的 RNA干扰试验采用的经典方法，是通过直接注射 dsRNA 到雌雄同体线虫的生殖器官，然后检查它亲代以及后代的表型。它的不足之处在于效率低，不适合用此法进行高通量筛选，同时干扰效果会随着细胞分裂而不断降低，不适合进行晚期表达基因研究。浸泡法是将线虫浸泡在 dsRNA 溶液中，但是干扰成功率不高。饲喂法是给线虫饲喂表达 dsRNA 的大肠杆菌，从而产生 RNA 干扰效果，该方法成功率近似于微注射，可大批量培养，成本低，主要
19、的缺点是需要在细菌中表达 dsRNA。目前已有 86%的线虫基因有现成的菌株可用。此次实验培养出 RNAi 型秀丽隐杆线虫的整体步骤是：提取秀丽隐杆线虫总 RNA 反转录合成 cDNA，cDNA 经过 RT-PCR 产生 Gene，Gene 经过双酶切产生 Gene 片段。另外L4440 质粒双酶切形成线性 L4440 质粒。Gene 片段与线性 L4440 质粒经过 T4 DNA 连接酶连接形成 L4440 质粒-Gene， L4440 质粒-Gene 转入到 E.coli HT115（DE3）中进行阳性克隆。阳性克隆后进行 PCR 鉴定。之后将阳性克隆产物进行 IPTG 诱导形成 Gene
20、-dsRNA，将其通过饲喂法导入到秀丽隐杆线虫，能产生对目的基因表达和功能的特异性干扰，从而培养出RNAi 型秀丽隐杆线虫。本实验所用的载体是 L4440 T7 双链载体，大小是 2790bp。该载体含有 Amp 抗性基因，可以在含有 Amp 的 NGM 平板中生长。本实验所用的 RNA 干扰菌株是 HT115（DE） ，其中有一个 Rnc 基因突变，使得特异性降解 dsRNA 的内切酶 RNase 的基因失活，这样有利于 dsRNA 的形成，可稳定表达目的基因 dsRNA。另外，此菌株中含有 DE3 lysogen，它可在 T7 启动子的控制下进行基因转录。此次实验中使用了 6 种不同的 R
21、NA 干扰菌株 HT115（含有能表达不同 gene dsRNA 的质粒） ，对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him 、sma-2 、lon 。同时还使用了起阴性对照作用的 RNA 干扰菌株 HT115，即转入了 RNA 干扰质粒空载体 L4440 的 HT115。在实验操作过程中还有以下几个方面需要注意：（1 ） LB 液体培养基的配制方法：配方：胰蛋白胨 10g/L，氯化钠 10g/L，酵母粉提取物 5g/L。用蒸馏水配制，配好后置于高压蒸汽灭菌锅中 121灭菌 15 分钟。（2 ） NGM 培养基的配制方法：配制 150mL NGM 培养基：NaCl 0.45g
22、、Agur 2.6g、Tryptone0.375g、ddH 2O146mL，之后置于高压蒸汽灭菌锅中120灭菌 15 分钟。然后在无菌条件下加入下列灭菌的溶液：CaCl 2（1M）0.15mL、MgSO4（1M） 0.15mL、磷酸缓冲液（1M， pH=6）3.75mL、胆固醇（1.5g/L）0.15mL、Amp（ 100mg/mL） 0.15mL、IPTG（1M）0.15mL 。配制 400mL NGM 培养基：NaCl 1.2g、Agur 6.8g、Tryptone1.000g、ddH 2O 390mL，之后置于高压蒸汽灭菌锅中120灭菌 15 分钟。然后在无菌条件下加入下列灭菌的溶液：C
23、aCl 2（1M）0.40mL、MgSO4（1M） 0.40mL、磷酸缓冲液（1M，pH=6）10mL、胆固醇（1.5g/L）0.40mL、Amp（ 100mg/mL） 0.40mL、IPTG（1M）0.40mL 。NGM 培养基在灭菌后加入的溶液中，胆固醇、Amp 与 IPTG 必须在 NGM 培养基冷却至60 以下后加，其他溶液没有这个要求。（3 ）胆固醇（1.5g/L）的配制方法：每毫升无水乙醇中加入 5mg 胆固醇。（4 ）使用高压蒸汽灭菌锅灭菌完成后要自然冷却降温，不要立即打开灭菌锅，否则会造成灭菌不充分。当灭菌锅的压力自然下降到 0.05kPa 后可以打开灭菌锅。（5 ）对线虫进行观察和操作时，培养皿正置去盖；观察和操作完毕随手盖上培养皿，严禁不同品系培养皿盖的混淆导致遗传混杂。（6 ）严格来说，培养皿平常应倒置放置，防止水分蒸发。（7 ）使用粘虫器（pick）挑取线虫时注意动作迅速，用力适度，不要对虫体和培养基造成损伤。在对每个培养皿操作前后，都应该过火灭菌，以防杂菌污染培养皿。（8 ）挑取线虫时，可以用粘虫器（pick）挖取一小块带有线虫的琼脂进行接种。参考文献1 张文霞，戴灼华.遗传学实验指导.北京：高等教育出版社，2007.
