1、蛋白酶活性测定方法一 蛋白酶活力单位定义1g 固体酶粉(或 1mL 液体酶)，在一定温度和 pH 值条件下，1min 水解酪素产生 1g酪氨酸为一个活力单位，以 u/g(u/mL)表示。二 测定原理蛋白酶在一定的温度与 pH 条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。三 应用范围本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。四 测定条件4.1 底物： 酪蛋白4.2 pH： 3.004.3 温度： 400.54.4 保温时间： 10min五 仪器5.1 紫外分光光度计5.2 超级恒温
2、水浴 400.25.3 秒表5.4 分析天平：感量 0.0001g六 试剂和溶液6.1.2 碳酸钠溶液 c(Na2CO3)=0.4 mol/L称取无水碳酸钠(Na 2CO3)42.4 g ，用水溶解并定容至 1000 mL。6.1.3 三氯乙酸 c(CCI3COOH)=0.4 mol/L称取三氯乙酸 65.4 g ，用水溶解并定容至 1000 mL。6.1.4 氢氧化钠溶液 c(NaOH)=0.5mol/L按 GB 601 配制。6.1.5 盐酸溶液 c(HCl)=1 mol/L 及 0.1 mol/L按 GB 601 配制。6.1.6 缓冲溶液a.磷酸缓冲液(pH=7.5) ，适用于中性蛋白
3、酶称取磷酸氢二钠(Na 2HP0412H20)6.02 g 和磷酸二氢钠(NaH 2PO42H20)0.5 g，加水溶解并定容至 1000 mL。b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸(80%90%)10.6 g，加水溶解并定容至 1000 mL。乙液 称取乳酸钠(70%)16 g，加水溶解并定容至 1000 mL。使用溶液 取甲液 8 mL，加乙液 1 mL,混匀，稀释一倍，即成 0.05mol/L 乳酸缓冲溶液。c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08 g，加水溶解并定容至 1000 mL。乙液 称取氢氧化钠 4.0
4、 g，加水溶解并定容至 1000 mL。使用溶液 取甲液 500 mL、乙液 400 mL 混匀，用水稀释至 1000 mL,上述各种缓冲溶液，均须用 pH 计校正。6.1.7 l0 g/L 酪素溶液称取酪素 1.000 g，精确至 0.001 g，用少量 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸 23 滴)湿润后，加人适量的各种适宜 pH 的缓冲溶液约 80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入 100 mL 容量瓶中，用适宜的 pH 缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注:3 )酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。6.1.8 l0
5、0g/mL L-酪氨酸 4)标准溶液a. 称取预先于 105干燥至恒重的 L-酪氨酸 0.1000 g，精确至 0.0002 g，用 1mol/L 盐酸 60mL 溶解后定容至 100 mL，即为 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液。注:4 )L- 酪氨酸采用上侮长江生化制药厂产品。b. 吸取 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液 10.00 mL，用 0.l mol/L 盐酸定容至 100mL，即得到100 g/mLL-酪氨酸标准溶液。七 分析步骤7.1 标准曲线的绘制（求 K 值）按下表 1 配制不同浓度的 L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算 K 值，(其 K
6、值应在 130135 范围内)。7.2 待测酶液的制备称取酶粉 12g，精确至 0.0002 g(或吸取液体酶 1.00 mL) ，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲液如此溶解、捣研 34 次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用( 稀释至被测试液吸光值在0.250.40 范围内)测定酶粉时稀释倍数参考下表 (液体酶亦可参照下表稀释) 。7.3 测定测定操作按下列所示反应顺序 样品管 空白管1加入待测酶液 2.0 mL 2.0 mL2 （预热 2 分钟）
7、3反应底物预热 3 分钟 4加入底物溶液 2.0mL 2.0mL(第二步)5混匀 640水解 10min 管号 取 100g/mL 酪氨酸标准溶液体积mL 取水体积 mL 酪氨酸标准溶液浓度 g/m L0 0 10 01 1 9 102 2 8 203 3 7 304 4 6 405 5 5 50酶活单位 总倍数 第一次稀释 第二次稀释25 万 2000 1g200mL(200 倍) 10mL100mL(10 倍)810 万 4000 1g200mL(200 倍) 5mL100mL(20 倍)7加入三氯乙酸终止液 4.0mL 4.0mL(第一步)8混匀 9静止 10 分钟 10.过滤 总体积 8.0mL 8.0mL滤液用紫外分光光度计，在 275nm 波长下，用 10 mm 比色皿，测定其吸光度(A)。7.4 计算X =AK8/21/10nE=2/5AKnE/m式中：X样品的酶活力， u/g(u/mL)；A试样溶液的平均吸光度；K吸光常数；8反应试剂的总体积，mL；2吸取酶液 2.00 mL，以 1mL 计；1/10反应时间 10 min，以 1 min 计；n稀释倍数 ；E紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为 0.50；酸性蛋白酶系数为 0.77)；m试样质量，g。7.5 结果的允许差 平行试验测定值之差不得超过 3%。
