1、线虫 RNA 干扰的基因沉默一、实验背景及目的1、RNA 干扰（RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中， RNA 干扰因为简单快速成为研究基因功能的有效手段。2、秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约 1mm，直径 70um，由 959 个细胞组成。它具有生活周期短、易培养和保存等优点。秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。雌雄同体的线虫有两条 X 染色体和 5 对常染色体。其基因组大小为 80Mb，包含 13000 个基因。秀丽线虫在 20时生活周期为 3.5 天，25 时约为 3 天，15 时约为 6 天。受精卵经过胚胎发生孵化出 L1、L2 、 L3 、L4 ，最后成为成熟的
2、幼虫。当食物缺乏或群体密度过大等环境不良的条件时，L2 会不进入 L3 而成为 dauer 幼虫来抵御不良环境，当环境恢复后 dauer 幼虫不经过 L3 直接进入 L4。因此可以利用该特性保存线虫品系。3、RNAi 是一种基因 knock down 技术，将体外合成的含有目的基因的 dsRNA通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因 mRNA 降解，从而达到基因沉默的目的。通过显微注射 dsRNA 或者把线虫浸入到含有 dsRNA 的溶液中，或者用能够表达 dsRNA 的大肠杆菌喂食线虫，可以将 dsRNA 导入大肠杆菌中。在大肠杆菌 HT115 中，含有目的基因发夹结构的质粒，
3、在 IPTG 的诱导下转录出正义和反义的 RNA,两条 RNA 链通过退火形成 dsRNA。当线虫以此大肠杆菌为食时，他们就摄取了大肠杆菌合成的 dsRNA，并触发了线虫体内RNA 干扰的发生。4、本实验将利用表达 tag-214dsRNA 大肠杆菌喂食线虫来介导 RNAi，以达到鉴定 tag-214 基因功能以及观察实验效果的目的。2、实验材料及试剂1、材料：1） 秀丽线虫（C.elegans）rrf-3 突变体（RNAi 敏感型） 2） 大肠杆菌（E.coli）野生型菌株 OP503） 带有 tag-214 发夹结构质粒的 HT115 菌株。2、试剂：1） NGM 普通固体培养基2）含有
4、Amp+和 IPTG 的 NGM 固体培养基（用于 RNAi）3）LB 培养基4）M9 缓冲液3、实验操作由于此次试验培养基配制以及大肠杆菌培养等的前期过程是由两个大组分别进行的，我询问了第二大组的实验相关步骤，但还是会有纰漏，所以有些实验过程和实际的操作会有差错，有些细节也会省略。1、配制 NGM 固体平板，M9 缓冲液，LB 培养基具体配制所需要的成分和用量在实验书上均有，需要在比例和一些操作上多加注意。1）NGM 普通固体平板每组需要配制 500ml（实际上配少了） ，其中的细菌蛋白胨为 peptone。胆固醇以及磷酸钾缓冲液要在其他组分混合并且高温灭菌之后加入，统一倒平板，放置 20h
5、 左右至表面干燥。2）LB 培养基中的胰蛋白酶冻是 typtone，我们每组配制了 500ml，121高压蒸汽灭菌。3）Amp+为 200mg/l tet+为 100mg/l IPTG 为 1Mm ,均需要抽滤之后放入离心管中。4）第二大组配制 LB 培养基（Amp+ tet+）NGM 固体平板（Amp+）IPTG 浓度为 4mM。2、大肠杆菌的培养1）在 NGM 普通固体平板上划线培养大肠杆菌 OP502）在 NGM 固体平板（Amp+ tet+）上划线培养大肠杆菌 HT115(对照组和实验组)3、大肠杆菌的活化1）大肠杆菌 OP50 的活化：挑取少量的大肠杆菌 OP50 到 LB 普通液体
6、培养基中，37振荡培养 20h。之后铺到 NGM 普通固体平板。2）大肠杆菌 HT115 的活化：挑取少量的大肠杆菌 HT115(对照组和实验组)到LB 培养基（Amp+ tet+）中，37振荡培养 20h。3）大肠杆菌 HT115 的再活化：吸取 1mL 的大肠杆菌 HT115(对照组和实验组)到 LB 培养基（Amp+ tet-）中，37振荡培养 20h。之后铺到 NGM 固体平板（Amp+ tet+）上。4、rrf-3 突变体的培养：将线虫 rrf-3 突变体接种到含有大肠杆菌 OP50 的 NGM 普通固体平板上，20培养。5、线虫扩繁（用到 chunck）选择线虫 rrf-3 突变体
7、培养基中未受到污染而且线虫长势较好的部分切下一小块(手术刀蘸酒精，酒精灯烧，重复三次)，接到大肠杆菌 OP50 的 NGM 普通固体平板上。20培养（由于线虫长势问题，培养了接近三天）6、线虫生长周期的同步化1）取 3mL 的 M9 缓冲液加入到线虫 rrf-3 突变体的 NGM 普通固体平板，反复轻轻地晃动平板，将平板上的线虫冲洗下来，然后将含有线虫的 M9 缓冲液转移到 15mL 的离心管中。2）向离心管加入 2mL 的 Naclo 溶液和 1mLNaOH(5mol/L)溶液，之后马上盖紧盖子剧烈晃动离心管。当发现溶液中的线虫身体呈现弯曲状，并且还没有出现絮状物时，加入 M9 缓冲液至 1
8、5mL 以终止反应。 3000r/min 离心 1min。3）弃上清，加 M9 缓冲液至 15mL，3000r/min 离心 1min，重复。4）弃上清，小心吹打沉淀，并将沉淀滴入未铺菌的 NGM 普通固体培养皿中央，20培养 16-20 小时。7、收获 L1 幼虫及 chunck1)培养 16-20h 后，NGM 平板上的线虫发育成 L1 幼虫。取 500uL 的 M9 缓冲液冲洗平板中的线虫，并将冲洗下的 L1 幼虫放到 1.5mL 的离心管中。将 L1 幼虫平均分为两份，分别接到大肠杆菌 HT115(对照组和实验组)的平板中。20培养。2)将培养线虫的培养基选择无污染且线虫长势较好的部分
9、切下来一小块，接到OP50 平板上， 对照组和实验组分别接 1 个大板，普通的小板两个（培养线虫留着做后续的实验的） 。8、Single worm（挑单个虫）睫毛依次蘸取 Naclo 、70%乙醇、无菌水/M9 缓冲液，在显微镜下分别挑取实验组和对照组的线虫，分别放在两个含有 OP50 的 NGM 固体培养板上，每个平板里两只线虫（我们有的平板里会多挑取一只） 。9、观察 RNAi 的表型和效率第二天在显微镜下观察并且对实验组和对照组平板内的卵进行计数。4、 实验结果这是我们计数得到的结果对照组 实验组 1 2 1 2虫卵数 35 81 3 1 接虫数 2 3 2 2虫卵数/接虫数 17.5
10、27 1.5 0.5我将对照组和实验组的虫卵数/接虫数取了平均值，并运用 EXCEL 做成了柱状图进行明显的比较。5、结果分析从数据以及图标结果看来，对照组平均产卵比例远高于实验组的产卵比例，说明 tag-214 基因有控制线虫产卵的功能，当这种基因被沉默掉后，线虫的产卵率明显下降，另一方面也说明此次的 RNA 干扰实验做的比较成功，得到了与理论相一致的结果。但是在实验过程中，我们也出现了一些问题，包括有平板的杂菌污染，最后得到的去做 RT-PCR 的菌也较少，所以，在下面，主要对这些细节错误以及过程中的注意事项进行分析：1、在实验过程过需要配制的试剂以及其它溶液要根据配方和用量，按照一定比例
11、配，在秉着不浪费的前提下可以多配制一些，以备不时之需。2、在对大肠杆菌或者线虫进行培养或者操作的时候，一定要在超净台，而且不要通过其他方式造成污染。在后面 chunck 的时候，由于好多平板上都被污染，干净的平板已经不够了，所以我们最后缺少的平板只能挑选污染最小用，这也给我们后来的实验造成了很大的干扰，因为污染并没有排除，而是越来越重，导致培养的线虫不能用。3、冲洗 L1 幼虫并分板培养的时候，尽量把幼虫的量平分，否则有的板长出来的虫多，有的少，而我们虫多的平板被污染了，所以后面 RT-PCR 的线虫是使用老师提供的线虫进行的实验。4、在挑取线虫的时候，睫毛要按照顺序依次蘸取 Naclo 、7
12、0% 乙醇、无菌水/M9 缓冲液，顺序不要错也不要落下，最后在计数的时候可以选择在平板表面进行十字划线计数法，这样计数可以简单方便一些。RNA 的提取、鉴定以及 RT-PCR1、实验背景1、RNA 的制备是通过 cDNA 途径克隆目的基因，了解基因在不同的组织或细胞中的表达水平，以及研究基因转录调控等必不可少的实验技术。RT-PCR 是将 RNA 的逆转录和 cDNA 的聚合酶链扩增相结合的技术。2、本次试验利用 Trizol 法提取 RNA ，Trizol 的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可以裂解细胞，促进核蛋白体的解离，并将 RNA 释放到溶液中；苯酚会使蛋白质变性，加入氯仿后
13、可抽提苯酚，促使 RNA 进入水相。3、RNA 是一类极易被降解的分子，因此要得到完整的 RNA 必须要最大限度的抑制提取过程中内源或者外源的 RNA 酶活性。提纯得到的 RNA 可以使用非变性和变性凝胶电泳进行检测。非变性 RNA 凝胶电泳可避免使用有毒的物品，但是由于 RNA 分子相互作用形成大量的双链结构，故无法判断 RNA 的相对分子质量。在完全变性的条件下，RNA 分子完全伸展，其电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA 分子相对分子质量时，一定要用变性凝胶。4、在总 RNA 分子中以 rRNA 最多，占 80%-85%，完整为降解的 RNA 分子的电泳图谱可以清
14、晰地看到 28srRNA、18srRNA、5srRNA 的三条带。如果 28s和 18s 条带明亮，条带边缘清晰，且 28s 条带的亮度是 18s 条带的两倍以上，则认为 RNA 没有被降解。经过鉴定未降解的 RNA 分子可通过 RT-PCR 反应对某一特定的基因进行扩增。RT-PCR 反应由两部分组成，首先是以 RNA 为模板合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板通过 PCR 扩增目的片段。用于逆转录的引物有随机引物、Oligo dT 以及基因特异性引物。Oligo dT 适合具有 polyA 尾巴的RNA，不能用于原核生物的 RNA，真核生物的 rRNA 和 tRNA 等。5、本实验的目
15、的是以线虫为实验材料，通过提取总 RNA，利用 RT-PCR 技术扩增线虫的 acting 基因的片段，学习并掌握 RNA 提取和鉴定，以及 RT-PCR反应的基本原理和实验技术。2、实验材料与试剂1、实验材料：秀丽隐杆线虫野生型 N22、实验试剂：Trizol、氯仿、异丙醇、75% 乙醇、琼脂糖、 DNA 上样缓冲液、RT 试剂盒，Premix Tap 酶。3、实验操作1）RNA 分子的提取1、2 mL M9 溶液 1500 r/min，离心 1 min 收集线虫；将虫体转移到无 RNA 酶的研钵中，加入液氮研磨。其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。2. 收集研磨的粉末，按 50100 mg
16、 组织/mL Trizol 加入 Trizol，室温静置 5 min。3. 12,000 r/min 4 离心 10 min。4. 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀)。5. 加入氯仿（200 l 氯仿/mL Trizol ） ，盖紧管盖，用力震荡 15 秒，再室温静置3 min。6. 12,000 r/min 4离心 10 min。7. 从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中。8. 向上清中加入异丙醇（500 L 异丙醇/mL Trizol)，上下颠倒充分混匀后，室温静置 10 min。9. 12,000 r/min 4离心 10 min。10. 小心弃去上清
17、，缓慢地沿离心管壁加入 75的乙醇 l mL，轻轻上下颠倒离心管，12,000 r/min 4离心 5 min 后，小心弃去乙醇。11. 室温干燥沉淀 25 min 后，加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀。12. 待 RNA 沉淀完全溶解后进行 RT-PCR 反应。2）通过甲醛变性凝胶电泳鉴定提取的 RNA这一部分是老师为我们完成的，具体的操作步骤就是按照 ppt 上的来看的。1.将电泳槽和制胶用具在 0.3% H2O2 中浸泡 30 min，取出后用 DEPC 水冲洗并晾干。然后用 75%乙醇冲冼一遍，晾干备用。2配制琼脂糖凝胶：（1）称取 0.5 g 琼脂糖，置干净的 100 m
18、L 锥形瓶中，加入 36 mL DEPC 水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。（2）胶冷却至 6070 后，依次向其中加入 9 mL 甲醛、5 mL 10MOPS 缓冲液和 3 L 溴化乙锭（1g/L） ，混合均匀。（3）倒入已放置好梳齿的胶板内，于室温放置 30 min 以上使凝胶凝固。凝胶凝固后，小心取出梳齿，将胶放入电泳槽中，加入 1MOPS 缓冲液使凝胶刚好浸没。3样品准备：（1） 取 DEPC 处理过的 500 L 小离心管，依次加入 10MOPS 缓冲液 2 L、甲醛 3.5 L、甲酰胺（去离子）10 L、RNA 样品 4.5 L ，混匀。（2）将离心管置于 60 水浴中保温 1
19、0 min，再置冰上 2 min。（3）向管中加入 3 L 上样缓冲液，混匀。4上样：将上述处理好的样品依次加入凝胶的各加样孔中。5电泳：将样品加入加样孔后，以 34 V/cm 电压降电泳，当溴酚兰移动到胶的 3/4 处停止电泳。6检测和分析：电泳结束后，在紫外灯下检查结果。3）RT-PCR 反应1. 逆转录 RT 反应（1）取 3 g RNA ，2gOligo dT 至 eppendorf 管中，70 10 min，高速离心5 sec 后置于冰上，目的是打开 RNA 的二级结构；（2）按下列顺序在一新管中加入以下试剂（20 L 体系）：MgCl2（25mmol/L） 2.4 L5 Rever
20、se Transcription buffer 4 .0LdNTP mixture（10 mmmol/L） 1.0LRecombinant RNasin RibonuClease inhibitor 1.0LAMV Reverse Transcriptase 25 U/L 0.6 L（15 U）RNA 1 g用 RNase-free ddH2O 补足至 20 L（3）反应过程： 25 5min ,42 1h ,70 15min ,4放置继续或者20 保存。2. PCR 反应（反应体系为 25uL）Premix Ex Taq 12.5 LSense 引物 (10 M) 1 LAntisense
21、引物(10 M) 1 L cDNA 5uL(稀释 5 倍)用 ddH2O 补足体积至 25 LPCR 反应条件为：94 1 min94 30 sec55 1 min72 30 sec（从 94 30 sec 至此步骤重复 30 次）72 5min3. DNA 琼脂糖凝胶电泳检测 RT-PCR 实验结果。4、 实验结果及分析本次实验结果主要是根据 RNA 和 DNA 电泳结果来判断成功与否的。所以在接下来附上电泳结果。电泳结果图：1、RNA 甲醛变性凝胶电泳鉴定图2、DNA 琼脂糖凝胶电泳检测图5、 实验结果分析1）RNA 甲醛变性凝胶电泳鉴定图在电泳图中与 MAKER 条带对比可以发现三条条带
22、，由远及近分别为18srRNA、18srRNA、5srRNA。其中，5srRNA 含量少，所以条带较暗，很不清楚；18srRNA、28srRNA 条带均很亮，条带边缘比较清晰，而且 28srRNA 条带的亮度可以达到 18srRNA 条带亮度的 2 倍，说明我们组提取的 RNA 没有被降解。但是在上样孔处有一条暗暗的条带，查阅资料说，上样孔处如果有条带，说明有 DNA 污染。整个组基本上都存在或明或暗的条带，但是从后面的结果来看，其他大多数组都没什么影响，只有我们组出现了一条杂带，所以，我认为，少量的 DNA 污染对实验结果的影响较小。不过，不能排除影响的存在，所以在 RNA 沉淀以及沉淀分离
23、的过程中一定要多加注意，要把上清弃的干净些，否则稍有的才能留可能会造成很大的影响。2）DNA 琼脂糖凝胶电泳检测图我们是第一大组第四小组，从最后的实验结果来看，我们组确实获取到了RNA，逆转录得到了 cDNA,因此也在 PCR 之后扩增得到了 Acting 的基因片段。但是，唯一的缺憾是，我们的电泳条带中竟然多出了一条较清晰明亮的杂带，第 3 小组也有，但是亮度很暗，我也看了第二大组的结果，未出现相同的状况。通过在网上查阅资料，分析在该过程中出现杂带的原因：1、内参引物的特异性不好，可能是非特异性扩增导致。2、反转的 cDNA 里面含有较多的基因组DNA，可能是 RNA 提取质量不到位导致，碰
24、巧这对内参引物横跨了内含子，从而导致 PCR 出现 2 条带。加上之前 RNA 点用的结果，整体分析，我觉得出现杂带的原因是之前 RNA 提取的不到位，含有少量的 DNA ，在整个过程中，大家所添加的引物都是相同的，所以，应该不会产生非特异性扩增，在之前的 RNA 电泳结果中，我们组的上样孔处有杂带，是有 DNA 污染的迹象。不过，其他组的RNA 电泳结果也存在 DNA 污染，最终的 DNA 电泳结果却未出现杂带，排除宏观因素，如果是在我们添加引物的时候我们出现问题，添加过少、之后未被混匀等的因素，也是有可能。6、实验注意事项1、由于 RNA 酶是极易被降解的，所以整个过程一定要带手套和口罩。
25、而且用试剂的时候一定要仔细看好了，在添加的时候一定要添加去 RNA 酶的等经过处理的。2、在加入异丙醇沉淀 RNA 要混匀，使 RNA 充分沉淀，弃上清，要干净，再加入乙醇后，也要充分混匀并将上清弃的干净，否则若残留 DNA，对后面实验的会产生影响。3、提取到的 RNA 要待 RNA 沉淀完全溶解后再进行 RT-PCR 反应。4、其余步骤主要按照实验书和老师授课的认真做。7、思考题1、如何防止提取过程中 RNA 的降解？1）尽量避开 RNA 专用操作区，离心机、移液器、试剂等均专用，并保持清洁。2）操作过程中应始终戴一次性 PE 手套，并经常更换，戴口罩避免交谈。3）尽量使用一次性已去除 RNA 酶的塑料制品、吸头、离心管等以防交叉感染。4）配制用的酒精、异丙醇、TRIS 等应采用未开封的新瓶。5）玻璃和金属器皿需要 180干烤 6-8h。2、提取的 RNA 有什么应用？1）逆转录形成 cDNA，PCR 扩增后可用于基因工程。2）成为 dsRNA，用于 RNA 干扰技术。3、确定 RNA 质量的方法有几种？1）检测 RNA 溶液的吸光值A260/280=2 时为纯的 RNAA260/280=1.8 时为双链 DNAA260/2802.2,时 RNA 已水解为单核酸2）RNA 电泳图谱：变性凝胶电泳，与 Maker 进行对比。
