1、第五章动植物细胞培养动力学,5.1、动植物细胞培养的特性5.2、植物细胞培养及反应动力学5.3、动物细胞培养及反应动力学,本 章 主 要 内 容,2007年，全球销售额最高的6大类生物技术药物，分别是肿瘤治疗药物、anti-TNF alfa药物、EPO、胰岛素、beta-干扰素和凝血因子。这6大类中有5类都是经哺乳动物细胞表达生产的，只有beta-干扰素是大肠杆菌和酵母表达的。所以，应看到动物细胞大规模培养是当前生物药物生产的主流方式。,5.1 动植物细胞培养的特性,动植物细胞培养技术：是一项将动植物组织、器官或细胞在适当的培养基上进行无菌繁殖的技术。5.1.1 动物细胞培养的特性 由于动物细
2、胞体外培养具有明显的表达产物的优点，为传统微生物发酵所无法取代，因此，生物技术中许多有价值的生物制品，需要借助于动物细胞培养而获得，这种需求极大地促进了动物细胞培养技术的发展。,早在1907年，美国的Harrison在世界上首次将蛙的神经组织在试管内培养成功，建立起动物组织体外培养的第一块基石。 1950年前后，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。 作为大规模细胞培养，Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾细胞（BHK）的悬浮培养。随后，采用在培养液中添加人工合成的小球状惰性聚合体载体，大幅度提高了细胞的产量，并在10000升发酵
3、罐内成功地进行深层培养。,随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到有许多基因产物不能在原核细胞内表达，它们需要经过真核细胞所特有的翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一样的功能和抗原性。使得动物细胞一跃成为一种重要的宿主细胞，用以生成多种生物制品，例如病毒疫苗、淋巴因子（干抗素和白细胞介素等）、单克隆抗体、红细胞生成素、纤维蛋白溶酶原激活剂、第八因子、肿瘤坏死因子、上皮生长因子和过氧化物歧化酶等。这些采用大规模细胞培养技术生产贵重药品在临床诊断、治疗和预防等方面都有重要意义。,动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素；大多数哺
4、乳动物需附着在固体或半固体的表面生长；对营养要求严格；大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验。,动物细胞培养与微生物培养的不同点,动植物细胞培养与微生物培养性能的相比,Vero细胞建株于1962年3月27日，是由日本千叶大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita从一只正常的雌性成年非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)的肾中分离得到。1964年6月15日，已传至93代的该细胞系被送往美国国立卫生研究院(NIH)下属过敏与传染性疾病国家研究院(National Institute of Allergy and Infectious Diseases ，NIAID
5、)的热带病毒研究所。随后提交给ATCC，代次为113代，再经放大建库被繁殖到121代。到了厂家，又需建立主库和工作细胞库，再经培养，所以大部分的疫苗制备都是在130或140代上进行的。,CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，于1957年建株。在各种哺乳动物细胞表达系统中，CHO细胞是生产蛋白药物的首选宿主细胞，其应用较多的表达系统有CHO-dhfr、CHO-NEOSPLA和CHO-GS三种，其中CHO-NEOSPLA最适于表达单克隆抗体，也可与CHO-dhfr或CHO-GS一样，用来表达重组蛋白。,48 h,192 h,生长在纤维材料中的细胞扫描电镜照片(
6、引用Shang等),正常细胞,凋亡细胞,分裂中期细胞,传代培养的绍鸭成纤维细胞形态（DAPI染色）,动物细胞培养基的配方十分复杂，并且还需补充血清和蛋白胨。 原料的质量控制和培养基的生产是大规模细胞培养的主要问题。因为血清来源困难，质量不稳定，残留血清给产物提纯带来困难等。虽然可采用无血清培养基，但在无血清培养基中更可能出现细胞毒。因此，与培养物相接触的水必须采用高纯度的水。 培养基一般需经膜过滤器过滤。可保证其无菌状态，但支原体也可被0.1m的过滤膜滤出。,目前，利用动物细胞培养的方法生产的有用产品大致可分为4大类：（1）疫苗 如狂犬病疫苗、麻疹疫苗和脊髓灰质炎疫苗等。（2）干抗素 如-干扰
7、素和-干扰素等。（3）单克隆抗体 如抗绵羊红细胞单克隆抗体等。（4）遗传重组产品 如人生长激素、免疫球蛋白等。,（1）生长速率慢，易为微生物等污染，但可采用在培养基中加入抗生素等措施；（2）细胞个体大且无壁，对环境敏感，因此应慎重解决供氧（搅拌与通风）与细胞脆弱的矛盾；（3）设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应过程的经验；（4）反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。,动物细胞培养过程的特征,动物细胞与微生物细胞的培养方法比较,表 动物细胞与微生物细胞的培养方法比较,5.1.2 植物细胞培养的特性,1902年，德国植物学家G.Haberlandt就预言植物细胞培养的可能性。 1937
8、年前后，法国和美国科学家分别成功的进行了胡萝卜和烟草的组织培养。 1966年Klein指出，能利用植物细胞培养物代替收集或栽培植株来生产生化制品。 近40年来，植物细胞培养研究成功的例子已有不少，如用紫草悬浮培养物生产紫草宁；烟草细胞的大量培养等等。,植物产生代谢产物的类型 根据分子结构不同大致分为： 酚类化合物：黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜类化合物：三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物：生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺） 非蛋白氨基酸 生氰甙 多炔类、有机酸,植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。 李时珍在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物
9、药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害是理想的环保产品。,植物次生代谢产品的市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病1820（美国）奎宁治疗疟疾510（美国）致热素杀虫剂20（全世界）毛地黄心脏病药2055（美国）,与微生物相比，植物细胞具有的特性,细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，抗剪切能力低；与动物细胞培养类同，生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素；细胞培养需氧，而培养液粘度大，且不能强力通风搅拌；产物在
10、细胞内且产量低；细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养的难度等。,20世纪90年代以来，伴随着紫杉醇的研究成功并应用于临床，植物细胞培养及其次级代谢产物的研究进入了新的发展时期，尤其是诱导子、前体饲喂、两相法培养、质体转化、毛状亘和冠瘿瘤组织培养等新技术和新方法的发现和发展，更显示了植物细胞培养工程制药的广阔发展前景。 另外，将固定化技术应用于植物细胞培养中的研究对有效的改善植物细胞培养中出现的不足有一定成效。可以认为，固定化技术是有可能在植物细胞培养中得以应用。,细胞产物的工厂化生产,红豆杉与紫杉醇,人参皂甘的生产,表 植物细胞培养和从完整的植物 生产紫草宁的比较,悬浮培养生物反应器,机
11、械搅拌式反应器 优点:是能够获得较高的溶氧系数。 缺点:剪切力大。,植物组织培养的概念,植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。,5.2 植物细胞培养及反应动力学,5.2.1 动植物细胞的生长模型,一、 碳源与生长模型 微生物反应中，细胞的生长速率与限制性基质间的关系常用Monod方程来描述。同理，Monod方程也可以用于表达某些碳源与动植物细胞生长速率间的关系。例如，在植物细胞培养过程中，多以蔗糖为碳源，安田曾报道，烟草细胞在分批培养中，细胞的生长速率与蔗糖浓度的关系可利
12、用Monod方程来表达，此时,。,蔗糖为碳源时，植物细胞首先分解蔗糖为葡萄糖和果糖，而后优先利用葡萄糖。 分别以果糖或葡萄糖为碳源分批培养烟草细胞时,前者有：,后者为：,由于动植物细胞的培养过程是好氧过程，因此，许多科技工作者研究了与细胞呼吸速率相关的因素。 例如，人参细胞培养中，添加椰子汁后细胞的生长速率加快，耗氧量较不添加椰子汁时明显增大。 另外，也有报道，AcerPsedoplatanus 细胞培养中，细胞体内的含氮量与耗氧量有正比例关系。,二、 呼吸与生长模型,加藤等所获得的烟草细胞分批培养的结果表明：当氧为细胞生长的限制性因素时， 与Qo2有与上式相似的关系。说明植物细胞培养中氧的消
13、耗，部分用于维持代谢，部分用于生长繁殖，所获得的,一般好氧微生物的比生长速率与菌体的维持常数m及氧的比消耗速率Qo2有如下关系：,这可能是植物细胞培养过程中的重要特性。,与一般微生物的m 和Y值相比，m 很小而Y较大。,5.2.2 植物细胞的培养,一、植物细胞的培养操作培养方式： 根据所处状态的不同，分为悬浮培养与固定化植物细胞培养法， 根据操作方式的不同，又分为分批式、反复分批式和连续式培养3种。,植物细胞的分批培养与微生物的分批培养类同。由于操作简单，从实验室到大型罐广泛应用。 分批培养中，植物细胞的生长曲线一般呈S型，可明显观察出诱导期、对数生长期、减速期、静止期和衰亡期。但是与细菌和酵
14、母菌的培养相比，即使是生长速率快的烟草细胞，分批培养时间（一个周期）也要6天以上，生长缓慢。,1、分批培养,悬浮培养（cell suspension culture） 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。,1、愈伤组织诱导 要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。 适于悬浮培养 适于再生植株,植物细胞大规模培养的技术要求,从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产
15、量恒定的产物。细胞生长速度快，短时间内能生产较多产物产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中,植物细胞规模化培养体系的建立,种子细胞选择外植体高产细胞种子细胞增殖与放大培养大规模培养体系建立,若反应器内培养液体积为V，补加量为F（等于取出量），则比值F/ V称为替换率D。D与连续培养中的稀释率D不同，其与培养液取出至加入完成期间的比生长速率有如下关系：,在上式中，Xt和X0分别为时间t=t和t=0时的细胞浓度。硅地的实验结果表明，反复分批培养的生长速率DX要大于分批培养时的生产速率。,2、反复式分批培养,植物细胞的连续培养与微生物的连续培养相同，对于一单罐连续培养系统，与细胞生长相关的物料衡算式
16、为：,V 培养液体积 X 细胞浓度 t 时间 F 培养液的流加速率,3、连续培养,根据比生长速率和稀释率的定义，上式变形为：,(5-7),稳定状态下，=D，细胞生长速率为XD。畦地等人使用20吨罐，连续66天培养烟草细胞BY-2，细胞的生长速率 XD = 5.82g/(Ld) 。 一般连续培养的细胞产率高于分批培养的，但由于植物细胞生长速率慢，维持长时间的无菌状态是需要解决的基本技术问题。另外，单罐连续培养法并不能适应各种反应，因此，有必要开发一些新的方法。,紫杉醇：二萜类化合物最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分离广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症目
17、前主要来源于红豆杉属植物,紫杉醇简介,紫杉醇研发过程,NCI称其为过去15年中开发的最好的抗癌药物20世纪90年代抗肿瘤药的三大成就之一汤姆森科技桂冠奖,Ramesh Panchagnula, International Journal of Pharmaceutics.1998(172)1-15.,药源问题,红豆杉 主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种 之一生长缓慢 分布有限 Taxol含量低 树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人,人工栽培 采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗寻
18、找红豆衫的替代物 从红豆杉非树皮部位提取 产紫杉醇的非红豆杉植物,优点：生长周期缩短 简便、直接,缺点：1、紫杉醇含量低 生长缓慢 2、提取工艺复杂,药源问题解决办法（一）,药源问题解决办法（二）,化学合成全合成 1994年获得成功 现有六种途径半合成 以10-DAB和Baccatin 作为半合成原料获得紫杉醇 新方法用10-DAT,缺点：1、合成过程烦琐复杂，几十步 2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%）,优点：1、原料枝叶含量丰富、 提取相 对容易，充分利用再生资源 2、产率高 3、最具实用价值可以工业化生产 4、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造,缺点：合成过程相对复杂 （1
19、1步化学转化和7步分离）,药源问题解决办法（三）,生物方法组织和细胞培养微生物发酵生物合成 研究阶段 红豆杉生物合成途径基本明确 10种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量,优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定 生长 2、适应市场、方便调节 3、成分简单，有利于分离纯化 4、成本低、生长周期短 5、为半合成提供原料 6、有望工业化生产,缺点：1、产量低、不稳定 2、工业化放大研究,存在问题植物细胞培养时，其生长速度较慢，通常完成一次生产周期需45周才能完成；而微生物的工业发酵只需几天就可完成发酵全过程。,5.3、 动物细胞培养及反应动力学,5.3.1 动物细胞培养方法,
20、培养方法有两种类型： 非贴壁依赖性细胞的培养：来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于这一类型，其可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。 贴壁依赖性细胞的培养：大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类型，它们需要附着于适量正电荷的固体或半固体的表面上生长。,动物细胞培养的过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,剪碎组织,分散成单个细胞,细胞悬液,10代细胞,50代细胞,原代培养,传代培养,细胞株,细胞系,发生癌变无限传代,培 养 液,胰蛋白酶或胶原蛋白酶,正常细胞,分化程度低，分裂旺盛,动物机体组织,单个细胞,原代培养,稀释,分
21、装,传代培养,培养过程：,原代培养,能够进行悬浮培养的动物细胞是一类能无限繁殖的细胞，这样的细胞又称为确立细胞株。 由于动物细胞对剪切力的敏感，丰富培养基容易形成过多泡沫，这都增加了反应器操作的难度。 悬浮培养多采用分批式操作方法，其原理与植物细胞的类同。,另外，适用于动物细胞的还有一种连续式操作方法 灌流培养法。这种方法是把细胞置于某种封闭系统中，连续注入新鲜培养基的同时，连续等量排出用过的培养基，但不排出悬浮的细胞。采用这种方法后，从产物开始分泌时起，便可用快速纯化方法不断的从流出培养基中收集目的产物。 虽然灌流培养系统具有如上优点，但也存在培养基消耗量比一般悬浮培养高几倍，工作过程复杂，
22、培养物易受污染和培养细胞不稳定等缺点。,图（生化生产工艺学P221）,灌流培养系统可分为3类：（1）微小均质系统，如灌流悬浮细胞培养，微载体系统。（2）巨大均质系统，如把细胞包埋在微小球或凝胶中。（3）非均质系统，如边灌流边用过滤膜将细胞加以固定。 上述灌流培养方法属于微小均质系统中的灌流悬浮细胞培养。,大多数动物细胞需附着在固体或半固体表面生长，生长的细胞最终扩展成一单层，所以这种贴壁依赖培养有时又称为单层培养。 动物细胞能否在载体表面上附着生长以达到扩展成一单层的目的，取决于细胞的特性、载体的理化性质以及培养基成分。 例如，琼脂糖熔融后的冷却速率慢，使凝胶缓慢生成，则琼脂糖形成双螺旋似纤维型结构，能支持细胞在其表面上附着生长。相反，冷却迅速的琼脂凝胶不能支持细胞在起表面上附着生长。,1、简述动、植物细胞培养的特点与难点，并与微生物细胞培养相比较。2、植物细胞培养的基本技术包括哪几方面内容。3、影响植物次生代谢产物积累的因素有那些？4、试比较植物细胞培养中采用不同生物反应器系统的优缺点。5、生产用动物细胞的要求与获得方法。6、动物细胞培养的方法及要点。7、动物细胞生物反应器性能的比较。,复 习 题,
