1、第五章 DNA损伤与修复DNA damage and repair,秘晓林BI Xiao-Lin09/25/2015,基本情况,博士，教授，博士生导师中国科学院“百人计划”，辽宁省“攀登学者”主要研究方向： 肿瘤抑制因子功能与作用机制；DNA损伤应答过程中关键蛋白的定位与功能；参与DNA损伤应答的ncRNAs等EMAIL:BIXLDMU.EDU.CN,为什么要研究DNA损伤应答？(DNA Damage Response, DDR),DNA损伤类型和数量,DNA 损伤与疾病,第一节 DNA损伤,何谓DNA损伤？在内源或外源因素作用下，DNA结构发生的任何改变都称为DNA损伤DNA损伤的后果：一、
2、DNA失去作为复制和转录模板的功能，导致细胞死亡；二、DNA的结构发生永久性改变,一、DNA损伤的类型碱基的更替、缺失、插入、链的断裂、链内或链间的交联、DNA重排等。天然的线性染色体末端端粒？,二、损伤因素内源因素：染色体复制、活性氧等外源因素：紫外线、电离辐射、碱基类似物、修饰剂、烷化剂、化学诱变剂等。,三、突变的类型1.点突变：是指DNA分子中一个碱基的改变。 包括转换（嘌呤碱基嘌呤碱基）和颠换（嘌呤碱基 嘧啶碱基或嘧啶碱基 嘌呤碱基）2.插入突变：是指DNA分子中插入多余的碱基。3.缺失突变：是指DNA分子中碱基的丢失。 插入突变和缺失突变可引起移码突变。4.三联体扩增：脆性X染色体综
3、合征是由于FMR-1基因中CGG重复突变5.DNA片段重组,四、突变的后果1.中性突变基因突变（特别是点突变），不一定就是有害突变。突变是生物进化和分化的分子基础；只有基因型改变的突变，即碱基组成改变，但蛋白质分子中氨基酸未改变。如有些点突变发生在同义密码子的第二或第三位碱基，或发生在基因的内含子上。因此突变不一定就是损伤。,2.有害突变严重的突变或突变的长期积累，导致DNA复制障碍或不能进行，或基因表达异常，引起DNA损伤导致疾病。因此突变是某些疾病的分子基础,镰状红细胞贫血-点突变,第二节 DNA损伤的机制,一、自发性损伤1. DNA复制过程中的碱基错配（错误率为10-9，修复后降为10-
4、10 ）,2.三联体扩增（即三核苷酸重复）是指三个不同的碱基为一个单位重复排列而形成的DNA序列。理论上，基因组中应该含有10类60种三核苷重复DNA序列。如CAGCTG、GAATTC等三核苷酸重复序列。其中，CAGCTG、GAATTC、CGGCCG等三核苷酸重复序列序列与20种以上的神经-肌肉系统退行性疾病的发病有关。这些三核苷重复序列可以出现不明原因的扩增，从而累及所在或周围基因的正常表达或正常的生物活性。,19 q13.219q13.3,果蝇FMRP调节DNA损伤导致的细胞周期检验点和凋亡,fmr突变导致DNA损伤敏感,FMRP工作模式,Liu et al. Human Molecula
5、r Genetics. 2012,3.碱基的烯醇式-酮式或氨基-亚氨基异构体互变引起碱基错配,4.自发脱氨基CU引起U A、 AI引起I C、 GX（无配对碱基）,5.碱基丢失引起突变,二、环境因素诱发DNA损伤分子机制,（一）紫外线引起DNA损伤的机制当DNA暴露与260nm 的紫外线时，DNA链相邻的嘧啶碱基可形成5，6双键，产生嘧啶二聚体TT、 TC或CC，最常见为TT二聚体。人皮肤细胞受紫外线照射形成二聚体的可达5104/细胞/小时。此外，紫外线还可引起DNA链间交联、DNA与蛋白质交联、甚至断链。,（二）电离辐射引起DNA损伤的机制1.可导致DNA碱基改变电离辐射可产生OH自由基，引
6、起DNA链上碱基氧化修饰（如T转变为5-羟甲基尿嘧啶）、碱基开环（如腺嘌呤7，8-双键断开）和脱落。嘧啶与嘌呤更敏感。2.可导致DNA断链.OH自由基破坏脱氧核糖脱落或断裂3，5-磷酸二酯键使DNA断链3.可导致DNA链交联电离辐射可使同一条DNA链内或两条DNA链之间或DNA与蛋白质间发生交联。,三、烷化剂引起DNA损伤的机制烷化剂是亲电子化合物，分子中带有活性烷基。活性烷基可转移到DNA的碱基或磷酸基上，使之烷基化。鸟嘌呤最易烷基化。烷化剂包括芥子气、硫酸二乙酯、甲基-亚硝基胍、甲基甲烷碘酸、氮芥、硫芥、环磷酰氨、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等1.可导致碱基错配烷基常加到碱基的N（N7烷基化鸟嘌呤
7、G或N3烷基化腺嘌呤A）或O原子上，使烷基化的G与T配对。2.可导致碱基脱落烷基化鸟嘌呤的糖苷键不稳定而断裂，使DNA链产生无碱基位点，复制时可插入任何碱基。2.可导致DNA断链磷酸基上O的烷基化，使3，5-磷酸二酯键断裂4.可导致DNA链的交联,四、碱基类似物引起DNA损伤的机制碱基类似物在结构上与碱基相似，它们进入体内后，在DNA复制过程中，可替代碱基掺入而干扰DNA合成，引起碱基错配。碱基类似物包括5-溴尿嘧啶（5-BU）、 5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤等。,五、化学修饰剂和化学诱变剂引起DNA损伤的机制化学修饰剂能专一地修饰DNA分子的碱基导致碱基错配如亚硝酸盐（使C氧化脱
8、氨基变成U，导致G-C转变为A-T，或使A氧化脱氨基变成I，导致A-T转变为G-C ）、羟氨（使T脱甲基变为C，导致A-T转变为C-G ）致癌物黄曲霉素B也是导致序列的变化。丫啶类化合物、溴化乙啶等也引起DNA损伤。,第三节 损伤DNA的修复,在一定条件下，损伤的DNA分子恢复正常的过程。 修复方式有：直接修复、切除修复、重组修复、跨 损伤修复和SOS修复,一）、光修复光复活酶（即光裂合酶）直接修复嘧啶二聚体（见于细菌和低等真核生物）,一、直接修复,二）、DNA连接酶直接修复DNA断裂口,三）、烷基化碱基的直接修复例如，E.Coli的Ada酶和人类的O6甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）
9、可将烷基不可逆地转移到自身而完成修复，本身失活（自杀修复）。,四）、DNA嘌呤插入酶直接修复无嘌呤位点（AP site）,二、切除修复最普遍和常见的修复方式切除修复需要DNA特异内切酶、核酸外切酶、糖苷酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与。包括单个核苷酸切除和核苷酸片段切除修复。切除修复属于复制前修复,2.核苷酸片段切除修复 -UvrABC修复系统具有ATP酶活性的UvrA 与UvrB结合，并识别 与结合DNA损伤部位。 具有内切酶作用的UvrC 置换出UvrA，与UvrB- DNA结合。 UvrD（ DNA解旋酶）释放 切 下的损伤片段。 DNA聚合酶填补缺 口，并由 DNA连接酶 连接。,
10、人类着色性干皮病（xeroderma pigmentosis, XP）常染色体隐性遗传。皮肤对日光，尤其是对紫外线敏感。主要临床表现是皮肤雀斑样色素沉着，毛细血管扩张，局限性萎缩，疣状增生，浅表溃疡，最后可癌变。这种病人的XP类基因（XPA、XPB、 XPC、XPF、XPG ）有缺陷，导致DNA损伤后的修复障碍。,3. 错配修复當DNA复制時，掺入了错误的碱基，在校读时未被去除，可经由该通路的酶侦测出來，将其中一股切出，并加以修补。,三、重组修复-复制后修复,四、跨损伤DNA合成修复跨损伤DNA合成（Translesion DNA Synthesis, TLS是近年来新发现的参与DNA修复的又
11、一机制。TLS包括无错损伤旁路（error-free lesion bypass）及易错损伤旁路（error-prone lesion bypass）；易错损伤旁路可导致DNA损伤诱导的突变。跨损伤DNA合成，这是一种利用损伤核苷酸为模板，通过跨损伤DNA聚合酶使碱基掺入到复制终止处进行DNA合成，从而延长DNA的修复。,五、SOS修复诱导修复SOS修复是细胞DNA受到广泛损伤而难以复制的紧急情况下，细胞为求生存而出现的一种应急反应。此时，细胞需调动其所有的修复系统进行修复。20世纪50年代，Weigle首次在E .coli中发现SOS修复系统。1973年，Raelman首次称为SOS修复。S
12、OS反应诱导的修复系统包括避免差错修复（光修复、切除修复和重组修复）和倾向差错修复。诱导产生缺乏校正功能的DNA聚合酶，一方面进行修复，同时也容易造成碱基错配的机会而产生新的损伤。但总的结果是细胞可以生存下去。,SOS反应是由RecA 蛋白和LexA阻遏物蛋白相互作用引起的， LexA（22kD）阻遏物蛋白是许多基因的阻遏物。 RecA 蛋白是SOS反应的最初发动因子。 在ATP存在时，RecA被损伤的DNA激活而表现出蛋白水解酶活力，水解LexA阻遏物蛋白，使与修复有关的基因开放，表达产物即可对损伤的DNA进行修复。,DNA损伤修复缺陷与疾病,DNA损伤应答的若干关键因子与损伤的时间和空间关
13、系,Checkpoint,p53: “Guardian of Genome”,肿瘤抑制因子最初鉴定为癌基因获得性功能 “Gain of function”超过50%的肿瘤中突变或异常,主要功能,细胞周期检验点 (checkpoint)凋亡,p53 突变导致不同的转录谱Kollareddy et al. NATURE COMMUNICATIONS | Published 12 Jun 2015 | 6:7389,什么是端粒(telomere),天然的染色体末端染色体末端由DNA和蛋白质共同构成的结构来源于希腊语 telos =end meros =part,保护端粒的 “T-loop” 结构,端
14、粒的功能,维持染色体末端保护染色体不发生融合、降解等,荧光原位杂交检测端粒（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH),telomeres red centromere green,端粒长度,端粒随细胞分裂缩短,Mitotic clock of the cellHuman: 15-20kb, 50-100bp/cell division50-100 divisions,端粒与DNA损伤,unprotected telomere,DNA damage?,端粒缺陷, DNA损伤和疾病,干细胞的DNA损伤应答与癌症和衰老,2009年Nobel生理学或医学奖,f
15、or the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase.,Elizabeth H. Blackburn,Carol W. Greider,Jack W. Szostak,2015年Lasker基础医学研究奖,“For discoveries concerning the DNA-damage responsea fundamental mechanism that protects the genomes of all living organisms.”,参考文献,综述类
16、：Annual Review, Nature Review, Trends, Current Opinion etc.Goldstein et al. (2015). The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med 66: 129-143.Smeenk et al. (2013). The chromatin response to DNA breaks: leaving a mark on genome integrity. Annu R
17、ev Biochem 82: 55-80.Armanios. (2009). Syndromes of telomere shortening. Annu Rev Genomics Hum Genet 10: 45-61.San Filippo et al. (2008). Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu Rev Biochem 77: 229-257.Palm et al. (2008). How shelterin protects mammalian telomeres. Annu Rev Genet 42:
18、301-334.McKinnon et al. (2007). DNA strand break repair and human genetic disease. Annu Rev Genomics Hum Genet 8: 37-55.Durkin et al. (2007). Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet 41: 169-192.Stewart et al. (2006). Telomeres: cancer to human aging. Annu Rev Cell Dev Biol 22: 531-557.Kunkel et al.
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