1、LOGO生物化学生物医药系蒋丹北京联合大学生物化学工程学院第三章蛋白质2.6 蛋白质的性质与分离、分析技术2.6.1 蛋白质的性质2.6.2 蛋白质的分离和分析技术2.6.3 蛋白质分子中氨基酸序列的确定2.6.1 蛋白质的性质一、蛋白质的相对分子量二、蛋白质的两性电离及等电点三、蛋白质的变性四、蛋白质的胶体性质五、蛋白质的沉淀六、蛋白质的颜色反应七、蛋白质的含量测定一、蛋白质的相对分子量蛋白质的相对分子质量一般在一万至一百万道尔顿之间1道尔顿1C12绝对质量/121.6610-27千克测定蛋白质相对分子量的方法测定蛋白质中的某组分SDS-PAGE法凝胶过滤法超离心沉降速度法（一）根据化学组成
2、测定最小分子量1、测定蛋白质中某一微量元素的含量2、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量（二）SDSPAGE测定相对分子质量SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）SDSPAGE测定相对分子质量蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基 极性亲水烷基 亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键不同蛋白质的SD
3、S复合物形状也相似，均是长椭圆状。因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关。当SDS的总量为蛋白量的310倍且SDS单位浓度大于1mol/L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。并且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。SDS-PAGE中，蛋白质的相对迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系（三）凝胶过
4、滤法测定相对分子质量层析柱内填充带有网孔的凝胶颗粒。小分子蛋白进入孔内，大分子蛋白不能进入孔内而直接流出。相对分子量的对数与洗脱液体积呈线性关系，凝胶法只适于球状蛋白分子测量（四）超离心沉降速度法 超速离心法（ultracentrifugation）既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（sedimentation coefficient,S）表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状有关。6000080000转/分重力60万80万倍沉降系数：即每单位引力场沉降分子下沉的速率，它表示沉降分子的大小特性。因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超
5、速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。二、蛋白质的两性解离和等电点pI通常在6.0 左右二、蛋白质的两性解离和等电点蛋白质等电点的应用 等电点沉淀法分离蛋白质 电泳法分析分离 等电聚焦三、蛋白质的变性天然蛋白质分子受到某些理化因素作用，有序的空间结构被破坏，导致生物活性丧失，并伴随发生理化性质的异常变化称为变性作用。当引起变性的因素除去之后，蛋白质往往又可以恢复天然构象，生物活性也随之恢复，这种过程称为复性。引起蛋白质变性的因素物理因素：加热、紫外线、超声波、搅拌、研磨等。化学因素：酸、碱、有机溶剂、重金属盐、变性剂等。变性分可逆变性和不可逆变性。变性蛋
6、白质与天然蛋白质区别理化性质：溶解度变低，粘度增加，紫外吸收增加；生物活性丧失生物化学性质改变：变性后结构构散，易被蛋白酶水解；应用 利用变性： 酒精消毒、高压灭菌、紫外线灭菌 加热食物易消化 血滤液制备 防止变性：低温保存生物制品 取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)蛋白质分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。分子直径在1-100 nm内溶于水,不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜（可用透析和超滤分离纯化。）等性质胶体溶液的特点蛋白质胶体溶液保持稳定的两个因素：一、水化层二、双电层
7、四、蛋白质的胶体性质向蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏它的水膜或中和它的电荷，就很容易使其失去稳定而发生沉淀。使蛋白质分子聚集而从溶液析出的现象称为蛋白质沉淀。五、蛋白质的沉淀四、蛋白质的沉淀作用可逆沉淀非变性沉淀 温和条件，改变溶液pH或蛋白质所带电荷 蛋白质结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解pI沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法不可逆沉淀变性沉淀 强烈沉淀条件，破坏蛋白质胶体溶液稳定性 也破坏蛋白质结构和性质 沉淀不能再重新溶解加热沉淀强酸/碱沉淀重金属盐生物碱沉淀1.盐析法 将中性盐加入蛋白质溶液，高浓度的中性盐破坏蛋白质的水化膜并中和其电荷而使蛋白质析出。 常用：硫酸铵，硫酸钠，氯化钠等。 盐析一般不引起变性等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解盐溶 盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中蛋白质脱去水化层而聚集沉淀2.有机溶剂沉淀脱去水化层，使蛋白质沉淀，如乙醇、丙酮3.等电点沉淀加酸达到蛋白质的PI
