1、生物样本的常用保存方式及效果梳理生物样本是医学研究的重要资源，病理学组织和细胞样本是临床常见的生物样本，主要来源于临床手术、活检、穿刺等操作，可通过制备切片、涂片以及提取生物大分子，用于病理诊断及医学研究。样本是医学研究的基础，其质量在很大程度上决定着研究结果的准确性和可靠性。随着基因组学、转录组学以及蛋白质组学等研究手段的飞速进步，各种分析技术对生物样本的质量也提出了更高的要求1, 2。生物样本的质量鉴定目前尚未有统一标准，但其提取产物 DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的质量控制已较为成熟。因此，为了评估各保存方式的效果，可以通过检测样本中提取的生物大分子的质量来间接衡量生物样本的质量3。
2、目前生物样本及其提取产物主要有深低温和常温两大类保存方式，针对不同科研需求，更多的样本保存方式也不断相继问世，但各种方式的保存效率不尽相同4。本文将对当前国内外常用的样本保存方式及其效果进行分析和小结，为临床生物样本的保存提供可行的建议，为获得高质量的样本提供理论基础。一、深低温保存相比甲醛液固定的组织，低温冻存组织中可以提取到更高质量的生物大分子，以满足现代检测技术的需要5。但有研究表明， -25低温冻存约 1 年后，组织中的蛋白活性发生了显著下降6 。相比之下，深低温冻存（-196-80 ）的保存效果更佳，已成为一种广为接受的生物样本长期保存方式7。1. -196/-150深低温冻存是理想
3、的样本保存方式：目前，液氮保存（-196）是公认最可靠的样本保存方式，样本在此温度可长期保持稳定8, 9。然而，由于样本完全浸没在液氮中，游离的组织碎片可能会带来交叉生物污染的潜在风险，因此催生了气相液氮（-150）这种新型保存方式。所谓气相液氮保存，就是将样本置于液态氮以上、气相氮的包围之中，可以很好的避免交叉污染的风险。除此之外，还可以通过电力冰箱制冷达到-150的深低温。对于-150深低温的保存效果, 目前虽缺乏长期数据支持，但从理论上说，该温度应该可以满足样本的长期保存需求。因为-137是水的玻璃化温度，低于此温度时细胞内能导致内容物降解的一切生化反应均处于失活状态，可长期保存样本并保
4、证其质量10。但是，又有研究发现，一般的组织冻存液由 DMSO、血清、细胞培养液组成，需要现用现配。但是由于血清的成分不定，冻存液的稳定性差，使得这种组织冻存液的保质期较短，保存条件也较为苛刻。使用现有的组织冻存液冻存肿瘤组织时，只有极少数的肿瘤组织可以复苏或以肿瘤细胞的形式进行传代，更无法以原代肿瘤的形态增殖，且极易丢失肿瘤的原始突变，只能获得分子水平的数据信息。故而，现有的组织冻存液的应用范围狭窄，降低了肿瘤组织样本的应用价值和科研转化能力。上海赛立维生物科技有限公司研发的玻璃化冻存技术，使肿瘤组织暂时脱离生产状态，可在液氮中长期保存，使得肿瘤组织可以随时制备、保存和应用，这样的保存方式操
5、作简便，且成本低廉。移植后可使之以原代肿瘤的形态增殖或传代，且保存了肿瘤的原始基因突变。成功突破了活肿瘤组织冻存复苏后存活率低的难题，使得冻存的肿瘤细胞可长期保存肿瘤组织活性，组织复苏后可维持与新鲜肿瘤组织几乎相同的形态特征和功能。总结，赛立维研发的组织冻存和复苏试剂盒有如下优势：（1）冻存后可长期保存（10 年）。（2）复苏后形态功能与新鲜组织一致。（3）复苏后仍可分离原代肿瘤细胞。（4）冻存前后 PDX 成瘤能力基本不变。（5）可替代冰冻切片和石蜡固定组织。（6）实现 DNA、RNA 和蛋白活性保存。（7）手术标本、活检组织均适用。（详情请联系产品经理： 021-50675637（杨经理）
6、2. -80 深低温冻存联合核酸稳定剂也可作为较理想的样本保存方式：在不具备液氮保存条件的生物样本库，也可考虑使用-80深低温冰箱代替液氮来保存组织样本。那么，-80深低温冻存对组织的保存效果究竟如何呢？有研究发现，组织长期保存在-80环境，可以很好地保护其内部的蛋白成分，也可以提取到高质量的 RNA，与冻存在气相液氮（-150）中相比没有显著差异11；但也有研究发现，组织冻存在-80深低温环境，虽然其 DNA 产量、完整性以及 RNA 产量可以维持长达 7 年而不发生明显改变，但其 RNA 完整性却在冻存 5 年后开始下降12。因此有研究者建议将组织小份分装，加入 RNA 特异性稳定剂后再冻
7、存于-80环境，更有利于组织内 RNA 的保存10。关于蛋白质的保存，目前以深低温冻存为主，可以很好地保护其稳定性。也有研究表明，冻存之前添加蛋白保护剂，如海藻糖等，保存效果更佳13, 14。除外以上对生物大分子的检测，还有研究者对组织进行苏木素-伊红染色，发现组织冻存于 -80深低温 27 年后，光镜下其形态结构仍保持良好状态15。以上研究证明，在不具备液氮保存条件时，生物样本分装小份并根据需要结合核酸稳定剂后冻存在-80深低温环境，可以长期有效地保护其质量，以满足多种下游实验的需要。二、常温保存鉴于深低温冻存方式存在着一定的缺点和风险，诸如运输和操作不便、能源消耗大、空间利用率低等，样本的
8、常温保存技术应运而生。常温保存技术的原理可类比线虫的脱水休眠现象，利用某些特殊技术或容器将脱水干燥后的样本置于密闭环境中，隔绝水、空气、微生物等有害因素；或者向生物样本中添加保护剂，保护剂渗入组织细胞内部，使相关酶失活，从而达到常温环境下保护样本的目的16。在实际的科研中,除了直接保存生物样本之外,也可以将后续实验所需的生物大分子提取出来加以保存。因此，在研究样本常温保存方式的同时，研发人员也致力于探索如何在常温环境有效保存样本提取产物。下文列举了几种常用的常温保存方式，分别适用于不同的样本类型，包括样本和样本提取产物。1.特殊技术或容器：（1）石蜡包埋：石蜡包埋技术被广泛应用于组织学、免疫组
9、织化学等领域，技术成熟，历史悠久。一直以来科学家都致力于从石蜡包埋组织中提取高质量的核酸，用于分子生物标志物的检测，但是结果并不容乐观，不利于多元化、充分利用样本。在石蜡包埋操作之前，组织的固定非常重要。甲醛液因其固定效果好，且不会影响组织形态，一直以来都是石蜡包埋技术中应用最广泛的一种组织固定液。但甲醛会对组织内部的生物分子进行化学修饰，并且在蛋白与核酸之间形成交叉连接，从而影响生物大分子的质量17, 18。因此，近年来，为了从石蜡包埋组织中得到高质量的生物大分子，新型组织固定液的研究不断发展19, 20。以 PAXgene 为例，这是一种不含甲醛成分的新型组织固定液。研究发现，与新鲜冰冻组
10、织相比，组织经 PAXgene 或甲醛液固定后，其 RNA 完整性都有所降低，但RIN 值（RNA Integrity Number）仍大于 7 在公认许可范围之内。完成后续石蜡包埋操作后，甲醛液固定石蜡包埋组织中所得 RNA 明显降解，已不适合用于测序等下游实验，而 PAXgene 固定石蜡包埋组织中的 RNA 完整性只发生轻微下降，RIN 值仍大于 7。在组织学方面，两组组织切片经苏木素- 伊红染色后，光镜下未见显著差异，均保持良好的组织形态。由此可见，固定液不同，虽然对石蜡包埋后的组织形态没有影响，但从中提取的RNA 质量却存在显著差异。因此，常规甲醛液固定后的石蜡包埋组织目前仍旧是形态
11、及分子病理诊断最主要的样本来源，如能在取材后就使用新型固定液，石蜡包埋组织也可抽提到高质量的 RNA 等生物大分子，用于下游相关实验。（2）Flinders Technology Associates cards（ FTA 卡）：是美国 GE 公司下属Whatman 公司推出的产品，是一种经过专利化学配方浸渍的特制滤纸，内含特殊基质，可以将接触到的细胞裂解，然后与释放出的核酸紧密结合，保护 DNA 完整性。有研究者从肿瘤组织中分离出肿瘤细胞，用 FTA 卡常温保存后提取 DNA，并与新鲜组织抽提的DNA 进行质量比较分析，发现两组 DNA 的扩增能力和功能特性并没有显著差异21。另有研究发现全
12、血用 FTA 卡保存也可以得到高质量的 DNA,与乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血中的 DNA 没有显著差异22 。FTA 卡使用方便，安全稳定，可用于长期常温保存基因组、质粒等，但此方法会将细胞裂解，破坏了形态学结构，故存在局限性，也不适合RNA 和蛋白的保存。（3）DNA/RNAshells：是法国 Imagene 公司推出的产品。DNA/RNAshells 是用于保存核酸的一种容器，核酸脱水处理后置于这种微型金属管，配合后续的特殊包装系统，使其处于无水无氧的密闭环境,隔绝空气、水、光、微生物等因素对样本的影响，实现常温环境长期保存的目的。Clermont 等23 将 DNA 保存在 DN
13、Ashells 中置于常温常湿环境，18个月后未检测到明显降解。为了检测样本长期保存效果，研究者通常采用加速老化实验（accelerated aging study）在短期内模拟样本的长期保存条件并研究在此过程中生物大分子的稳定性：通过人工改变保存条件，升高温度、增加湿度使短期内样本的保存效果可模拟常温常湿下样本的长期保存效果，以缩短研究周期。基于此理论，Clermont 等将DNA 保存于 DNAshells 中并放在 76、50% 空气湿度环境下 30h，相当于常温常湿环境下 100 年24，再次检测 DNA 完整性依然未发生显著变化 25。也有人同时针对 DNA和 RNA 都进行了加速老
14、化实验， DNA 于 60常湿环境下保存在 DNAshells 中 8 天相当于常温常湿 14 年24 ，仍保持较高的浓度、纯度和完整性，可用于后续实验； RNA 于60常湿环境下保存在 RNAshells 中 16 天相当于常温常湿 7 年26，RNA 亦保持着较高的浓度、纯度和完整性，RIN 值仍维持 7 以上27 。以上研究结果均表明,在常温常湿的环境中,DNA/RNAshells 可以长期有效的保护 DNA、RNA，为下游实验分析提供高质量核酸样本，但尚未有文献报道可以常温保存蛋白的类似容器。2.样本保护剂：（1）DNA/RNAstable ：美国 Biomatrica 公司推出的产品
15、。是用于 DNA 或 RNA 的液相保护剂，核酸样本与之混合孵育后可在内部形成一种热稳定屏障，脱水干燥后核酸可长期保存于常温环境。DNAstable 对 DNA 的常温保存效果已有多项研究进行评估,证实加入DNAstable 后,DNA 能够长期保存在常温环境,其完整性不会发生显著变化 28, 29。同时有研究证实，加入 RNAstable 后的 RNA 常温保存 4 年多，其 RIN 值仍在 9 以上，可用于下游实验如 realtime-PCR、测序等30, 31。因此，DNA/RNAstable 适用于长期常温保存核酸，并有效保护其质量，但尚未有可以常温保存蛋白的类似保护剂。（2）Allp
16、rotect：荷兰 Qiagen 公司推出的产品，是一种胶状保护基质，可以渗透入组织内部并对其中的生物大分子形成化学保护。研究发现，将组织浸没于 Allprotect 后分别置于室温（19）和冰箱（8、-20、-80 ）四种环境保存 1 周，与液氮速冻后转入-80的组织保存方式相比，5 种方法保存的生物大分子质量没有显著差异。但遗憾的是Allprotect 对组织的长期保存效果不佳，比如组织浸没于 Allprotect 后存放于 8环境，其 RNA 完整性 1 周后就开始降低，RIN 值降至 7 以下； Western blot 检测到蛋白表达量在第 3 周就开始下降32。因此，Allprot
17、ect 仅适用于样本的采集阶段，或者作为一个中转途径，在将样本转移至更稳定的保存环境之前用以暂时保存组织。（3）RNAlater：美国 Ambion 公司产品，是一种液态组织保护剂。研究发现其可以渗透入组织内部对生物大分子形成化学保护，从而有效保护组织，同时不会影响下游实验的进行33, 34。近来，有研究者将酵母菌细胞保存于 RNAlater 中，4 放置 24h 后再转入-80，可以从中提取到产量、纯度、完整性均较高的 DNA、RNA 和蛋白质；细胞加入RNAlater 保护剂后冻存可以成功复苏并继续传代培养，其结构形态不受影响35 。有研究结果显示 RNAlater 对组织蛋白的影响与组织
18、种类有关,如 Abbaraju 等36 将组织样本经RNAlater 浸没后转入-80冰箱保存，这种方式可以很好地保护骨骼肌和脑组织中的蛋白质，而肝脏和心脏在同样的保存条件下却并不能得到相同质量的蛋白质。目前 RNAlater主要应用于组织的常温保存，适于采集或转移阶段,可以很好地保护组织 DNA 和 RNA，但当下游实验涉及蛋白分子时，则需根据组织种类选择合适的样本保存方式。（表 1：生物样本及样本提取物常用保存方式比较）综上所述，生物样本及其提取物的保存方式多种多样，各有利弊（表 1）。我们应综合考虑样本类型、经济、空间等各个方面的因素，根据实验计划和目的要求，选择最佳保存方式，保护样本质量，进而保证下游实验顺利进行。转自：eBiobank
