1、 双标记免疫荧光染色一、实验目的：1.检测 MT, IGF-1/FGF5 与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。2.检测目的基因所表达的蛋白定位。3.检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。二、实验材料：1.试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛地高辛抗体，生物素链霉亲和素）细胞核染料 DAPI2. 器材：激光共聚焦显微镜 显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。三、实验步骤：1.细胞培养：取对数期细胞于 6 孔板培养 24 小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要 24 小时，细胞数目达到 4104 个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组；2.实验组加药处理
2、：加入 MT 或 IGF-1 或 FGF5 处理 24 小时或 48 小时，72 小时。3.上镜前处理：将玻片取出，PBS 洗 3 次，4%多聚甲醛固定 15min；PBS 洗多次，加 0.1%Triton-X100 透化 10min；PBS 洗 3 次，5%FBS 室温封闭一到数小时；PBS 洗 3 次，将 MT、FGF-5、IGF-1 抗体(1：200)和目的基因(工作液) 两两组合，共六组，按体积比 1：1 混匀，一起加到切片上，4过夜；第二天，PBS 洗 3 次，加入荧光二抗加入 TRITC(罗丹明)标记羊抗兔 IgG(1：100)；37孵育 30 min；加人 FITC 标记山羊抗鼠 IgG(1：100)，室温避光 45min；（之后均为避光操作）PBS 洗 3 次，加入核染料，n 分钟；PBS 洗 3 次，灭菌水洗 2 次；取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约 30ul 防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。以 PBs 代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。4.镜检四、结果预测：1.共表达：两个基因分别为阳性红色，绿色。共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。2.正负表达：看荧光强弱。
