1、Hungate滚管法厌氧培养操作概要 以双歧杆菌培养为例： 实验步骤： 1.铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为 40400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有 O2，故当这些气体通过温度约 360的铜柱时，铜和气体中的微量 O2 化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入 H2时，H2 与 CuO 中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用
2、，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 2 预还原培养基及稀释液的制备 制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管(FM scientific 货号2651-6001)中，一般琼脂培养基装4.5-5ml，稀释液装9ml，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚地看到培养基内加入的氧化还原指示剂刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。 3 双歧杆菌样品不同稀释度的制备 在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1ml混合均匀的液体样品，而后加入装有预还
3、原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其震荡均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1ml 10-1稀释液至另一支装有9ml生理盐水的试管中，制成10-2稀释液。按此操作方法依次进行10倍系列稀释至10-7，制成不同浓度的样品稀释液。通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管培养计数。 4厌氧滚管培养法 将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于 50左右的恒温水浴中，用 1ml 无菌注射器分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.1ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于滚管机（FM Scientific 型号R10）上迅速滚动，这样带菌的融化培养基在试管内壁立
4、即凝固成一薄层。每个稀释度重复3次，而后置于37（酸奶样品42）恒温培养箱中培养。一般培养2448小时后，即可在厌氧管的琼脂层内或表面长出肉眼可见的菌落。 5.厌氧管清洗和灭菌方法 清洗厌氧管时，先用 2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至 pH 中性，干燥后贴上标签，标上菌号及时间，121下高压灭菌15-20分钟，备用。 6.注意事项 1注射器在使用前必须经过121、20min灭菌。 2注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。3用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。 备注：本操作概要仅供参考。
