1、什么是质谱仪?,质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子.测定分子量进行成分和结构分析. 离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化),主要组成部分: 1.进样部分 2.离子源 3.质量过滤器(分析器) 4.离子检测器,离子源,质量过滤/分析器,检测器,进样部分 样品板 LC或GC,EI源 FAB源 MALDI源 ESI源,Quadruopole Ion trap Time-of-flight,电子倍增器 闪烁计数器,+ + + +,+ + + + + + + + + + + + +,+,+,+,+,+,+,+,+,+,进样部分,要求：大气压下的样品要
2、进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。 方式：进样板进样进样头进样毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱）,C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization,MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。 1、使用基质，但基质为固体。 2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。 对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。,常用基质,1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽 2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白 3、龙胆酸（2,5二羟基苯
3、甲酸 DHB 聚合物 4、吡啶甲酸 PA 5、3羟基吡啶甲酸 3HPAMALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析,常用基质结构,DHB,SA,CCA,MALDI的优缺点,优点 1、质量数可达300,000Da。 2、attomole 至femtomole级灵敏度。 3、软电离方式，无或极少碎片离子。 4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。 5、适于分析复杂混合物。,缺点 1、分辨率低。 2、1000Da以下基质峰干扰。 3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。 4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。 5、不能分析非共价键相
4、互作用。 6、定量时需要内校准。 7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。 8、对各种赋形剂的容忍度低（如 含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。,Sample submission In solution, as concentrated as possible, volume 10-20 ul Minimum Concentration 10 pmol/microliter Use 200ul PCR-style eppendorf tubes,The sample should NOT contain any Azide SDS Brij 35 Tris base CHAPS Trito
5、n X-100, Treduced Triton X-100 DMSO Tween DMF Zwittergent Glycerol any other detergent Phosphate buffers Salts and buffers 100 mM,The following components are ACCEPTABLE Acetic or formic acid Acetonitrile, ethanol Guanidine/HCl 4M Hexafluoroisopropanol up to 40% Methanol Sodium chloride 10 mM Urea 1
6、M,D: ESI离子源 Electrospray Ionization,4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。一般分析物分子量 2000Da带多电荷,NANO-ESI喷雾照片,ESI特点,1、 ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆
7、质量分析器等质量范围窄的缺点。2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。,电荷数和质量数的计算,已知mj=(m+nj)/njmk=(m+nk)/nknj= nk+1推算出nj=(mk-1) /(mk- mj) nk=(mj-1) /(mk-mj)m=mjnj-nj=mknk-nk,m/z,相对丰度,mj,mk,ESI优缺点,优点 1、质量数可达70，000Da 2、灵敏度高达femtomole级。 3、软电离，可观察生物分子非共价反应。 4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。 5、没有基质干扰。 6、适于联四极杆质量分析器、离子
8、阱质量分析器做结构分析。 7、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。 8、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。 9、特别适于测多肽的修饰。 10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。,缺点 1、耐盐能力低。 2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。 3、样品需先气化，混合物不适用。 4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。 5、定量时需内校准。,质量分析器（过滤器）,第一节：质量分析器的主要指标 A、质量范围（/） 所能测量的质荷比范围 M+nHB、灵敏度一定浓度样品产生响应时，最低的浓度值。,n,D、分辨率 质谱分辨不同质荷比离子的能力分辨率R=M/ a=
9、M/(M M) ba 公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比b公式定义为相邻的相交10的两个峰M M按a 式计算的分辨率约为b式计算的两倍。,不同分辨率谱图效果,离子阱质量分析器,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,质量分析器的串联,目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析Collision-induced dissociation(CID)Ion source ion daughter ion granddaughter ion,选择离子,MS,CID,MS/MS,CID,MS/MS/MS,空间串联质谱仪,A、串联四极杆（三级四极杆） triple-Quadrupole Analyzer Q为
10、过滤单元Q为碰撞单元Q为分析单元,时间串联质谱仪,A、离子阱质谱仪：,几种串联质谱优缺点对比,第五章、质谱在生物学中的应用,一、肽质量指纹谱鉴定蛋白。二、串联质谱鉴定蛋白技术,三、肽序列标签技术,通过测部分氨基酸序列，结合此序列前后的离子质量和肽段母离子质量进行数据库检索，称为肽序列标签技术。,四、O标记从头测序技术,蛋白酶解时，酶解液中H2 O和H2 O各占50，酶解后肽段的羧基端上的羟基氧 O/ O丰度比1：1，使Y型离子系列的M+2/M同位素峰的丰度高于正常未标记 O的离子的同位素丰度比。,18,18,16,18,16,18,五、磷酸化蛋白质的鉴定,A：MA结合磷酸酶水解,磷酸化蛋白,M
11、S,蛋白酶水解,MS,磷酸酶脱HPO3,MS,通过比较几级质谱图，比较质量数少80Da或80倍数的肽段。,B、串联质谱进行母离子、中性丢失 扫描，分析含HPO3的肽段产生的特征离子，直接从混合肽段中找出磷酸化肽段。,C、PRD-MALDI-MS 用源后衰变技术寻找质量数少80Da或98Da的肽段来判断磷酸肽。,D、用IMAC技术分离/富集磷酸肽对比前后质谱变化寻找磷酸肽。 IMAC immobilized metal affinity固相金属亲和色谱。 IMAC 对磷酸肽有高选择结合能力，富集后用高PH或磷酸盐洗脱后测质谱 。,E、磷酸化位点的确定,找到磷酸肽后，串联质谱子离子扫描模式对磷酸肽
12、进行序列分析。,F、磷酸化定量分析,1、N稳定同位素标记法：,N培养基,14,15,N培养基,14,2、同位素亲和标记法,细胞池1,细胞池2,混合,消除氘,消除氢,亲和纯化,酶解,MS,磷酸肽或磷酸化蛋白在缄性环境下发生消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应，亲核试剂一种为氘原子、一种为氢原子，再接上一个亲和标签（如生物素biotin），混合酶解，提取含biotin的肽段进行MS检测。,六、糖基化蛋白的鉴定,A、用糖甙内切酶切断糖链与蛋白链间的糖甘键，将反应前后的质谱图比较，可知糖链的平均质量。,B、糖基化位点的确定,先用蛋白酶酶解成含糖链和不含糖链的肽段，获得其肽质量指纹谱，再用糖
13、苷内切酶切除糖链，其肽质量指纹谱将发生变化，含糖肽段发生丢失位移，通过网上数据库检索其序列，找到位点。,C、用凝集素直接提取含糖肽段，再结合质谱技术分析,凝集素对含糖肽段有专一亲和性,七、质谱在蛋白质组学中的应用,A、稳定同位素代谢标记技术。前面已介绍 B、同位素亲和标签技术,ICAT,专一与Cys共价结合,优缺点,优点 1、兼容分析任何条件下的体液、细胞、组织中的绝大部分蛋白。 2、烷化反应在盐、去垢剂/稳定剂（如SDS、尿素盐酸胍等）存在下都可进行。 3、只分析含Cys残基的肽段，降低分析复杂性。,缺点 ICAT本身分子量较大（500Da左右）增加数据检索复杂性。 无法分析不含Cys的蛋白
14、。,2DLC-MS的基本原理,Why 2D LC/MS?,可鉴定极端具有pI、疏水性、分子量的蛋白质 适合膜蛋白 重复性好 容易自动化 上样量大 高灵敏度（溶液酶切） 可根据样品灵活配置（但最后一维一般为RP）,Then why SCX/RP/MS?,SCX和RP的分离原理是互补的 SCX按荷电情况，PR按疏水性 流动相是兼容的 pH3，ACN/water/salt SCX流动相中的盐可以在RP时有效去除 Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留 Tryptic peptides在SCX条件下是稳定的,Separation power Peak capacities,2DE
15、500 - 10,000 protein spots Affinity Chromatography 2 Ion exchange Chromatography 10 protein level Gelfiltration 10 Reversed Phase Chromatography 50 Ion Exchange Chromatography 25 Reversed Phase Chromatography 100 peptide level 2DLC (IEX/RPC) 2,500 Linear IT MSn 18,000 mph*,*measurements per hour,Gel
16、,Gel spot,Proteolytic peptides,Mixture of Proteins,Digestion,Proteolytic peptides,Digestion,LC,Protein Identification Workflows,Peak Finding,Peak list,Search of a Sequence Collection,Identified and Proteins,Protein Candidates,Significance Testing,Protein Function?,Sequence Similarity Search,RPC,IEX,
17、RPC trap,RPC trap,on-line elution by salt plugs to trap column,IEX,off-line gradient elution with “classical” fraction collection,RPC,2D LC的三种配置形式,IEX,RPC,in-line MudPIT,on-line 2D-LC,优点 全自动 样品体积可根据后续RPC调整 在线脱盐、浓缩 自由选择缓冲盐,缺点 SCX峰容量有限 ACN浓度在IEX和RPC得一致 两相分离都没能在最佳状态下进行,off-line SCX with fraction collec
18、tion,优点 两维分离都有可能在最佳状态下进行，得到最好分辨率和峰容量 可自由选择缓冲体系 样品体积可根据后续RPC调整 速度快（只需一个SCX操作） SCX馏份可留待以后分析,缺点 自动化程度低,The secret behind sensitivity Reducing column dimensions,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,Tandem MS,Data dependent MS/MS,
19、基本原则 先做一次全扫描（full MS)，记录个丰度最高的离子 然后依次对这X个离子进行CID, 做MS/MS(full MS2) 然后再做全扫描, 下一个data dependent MS/MS开始 Dynamic exclusion 某个离子在做了一定次数（比如2次）的MS/MS后，将在一定时间内（比如3min）不再作为侯选离子。,+,多肽的裂解,碎片离子的命名,Residue name (A-Z) monoisotopic mass average massA 71.03711 71.0788B 114.53493 114.59625C 103.00919 103.1388D 115.
20、02694 115.0886E 129.04259 129.1155F 147.06841 147.1766G 57.02146 57.0520H 137.05891 137.1412I 113.08406 113.1595J 0.0 0.0K 128.09496 128.1742L 113.08406 113.1595M 131.04049 131.1925N 114.04293 114.1039O 0.0 0.0P 97.05276 97.1167Q 128.05858 128.1308R 156.10111 156.1876S 87.03203 87.0782T 101.04768 10
21、1.1051U 150.95364 150.034V 99.06841 99.1326W 186.07931 186.2133X 111.0 111.0Y 163.06333 163.1760Z 128.55059 128.62315,氨基酸残基质量,CID条件下tryptic peptides裂解规律 mobile proton model,在低能CID条件下，tryptic peptides主要产生以y离子和b离子为主的碎片离子 此外还经常可以看到y离子、b离子中性丢失NH3或H2O的峰 脯氨酸（P）残基N-端侧的肽键特别脆弱，因此含P的多肽MS/MS图谱一般会有一个脯氨酸N-端侧的肽键断
22、裂产生的特别强y离子。而脯氨酸（P）残基C-端侧的肽键一般不断，因此相应的碎片离子基本不出现 如果肽段中R数小于其所带质子（H+），肽段将以charge directed 方式裂解，碎片离子丰富；反之，则以charge remote方式裂解，碎片离子较少。在charge remote方式下D、E等酸性氨基酸残基C-端肽键易断 糖肽上的寡糖基、磷酸肽上的磷酸基在CID条件下更容易脱落，因此该类多肽的MS/MS图谱的base peak一般为母离子脱去修饰基团后产生的,ESI-MS/MS vs MALDI-MS/MS why LTQ/LCQ type instrument so popular in proteomics?,
