1、细胞株在适当的培养基中保持 10% FBS。从 Addgene(质粒) 购买 HA-FLAG-UCHL3。#22564，然后再克隆到 pGEX-4T-2 载体(Clontech) 中。UCHL3C94A 和 S75A 突变体由位点定向突变层积产生)。抗 uchl3 抗体购自 ProteinTech 公司(12384 - 1 - ap)。抗 ub (P4D1)、抗 rpa32 (9H8)、抗 brca1 (D9)抗体购自 Santa Cruz Biotechnology。抗 rad51 (N1C2)是从 GeneTex 购买的。反H2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和
2、anti-MDC1(05 - 1572)从微孔被购买。Anti-BRCA2( 推上 a303 国道- 435 a)和anti-H2AX 架 a300 型(- 081 a)从 Bethyl 购买实验室。抗 53bp1 (NB100-304)购自 Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-actin 抗体购买的 。反磷（血清/thr）atm/atr 衬底抗体（2851 ）是从细胞信号技术中购买的。CRISPR / Cas9 敲除(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5 -GCCGCTGGAGGCCAATCCCGAGG-3)和 sgUCHL3-2(
3、5-GCCCCGAAGCGCGCCCACCTCGG-3)。gRNA 序列被克隆到载体中。LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染sgRNA-puro 随后与 2g /毫升嘌呤霉素广泛的选择, 和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆抗 uchl3 抗体，并通过 DNA 测序验证。重组蛋白表达和下拉试验。构建表达 His-RAD51 和 GSTUCHL3 蛋白的质粒，构建 RAD51 和 UCHL3 的编码序列被亚克隆为 pET-32a 和 pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在 LB 培养基培养细菌在 37
4、C 到 1.2(OD600)和冷却 30 分钟在冰上。然后细胞连续培养 15 h 在 18C 添加 0.8 毫米 isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside 之后(IPTG) 。细胞然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物用 16000g 离心 30min，得到的上清液与他的 Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51 蛋白和 GSH 珠(Promega)，纯化分别是 GST 和 GST- uchl3 蛋白。体外 GST-UCHL3 拉试验,50g 重组 GST 和 GST-UCHL3 蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被 5%
5、BSA在 4C 2 h 其次是孵化与 50g His-UCHL3 额外 2 h 在 4C。然后用不同盐浓度的 NETN 缓冲液冲洗 5 次。结合蛋白被筛选了 1SDSPAGE 缓冲与加热 10 分钟在 95C。用单克隆抗his 抗体检测 His-RAD51，用 Coomassie blue 染色 GST-UCHL3体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验对于体内去泛素化实验，控制 U2OS 细胞，UCHL3 敲除 U2OS 细胞，或 UCHL3 敲除U2OS 细胞稳 定表达 HA-UCHL3 野生型和突变 Cys95 阿拉巴马州(CA 突变)在 120 年被细胞溶解 L 62.5 毫米 Tris
6、-HCl(pH 值 6.8),2% SDS、10%甘油,20 毫米 NEM,1毫米碘乙酰胺;煮 15 分钟;用含有蛋白酶抑制剂的 NETN 缓冲液、20mm NEM 和1mm 碘乙 酰胺进行测定 10 次;然后离心分离细胞碎片。细胞提取物的免疫沉淀与指示抗体和涂抹抗 ub 抗体。为了制备大量泛素化蛋白作为体外脱泛素实验的底物，HEK293T细胞与 Myc-RAD51 和 His-Ubexpression 载体一起转染。在变性条件下，用他的珠子从细胞提取物中纯化泛素蛋白。接下来，用 Ub-RAD51 蛋白从细胞提取物中纯化抗myc -琼脂糖颗粒在裂解缓冲液(50mm Tris-HCl pH)中
7、7.8, 137 毫米 NaCl, 10 毫米 NaF, 1 毫米 EDTA, 1% Triton X-1000.2%萨科齐 ，1mm DTT, 10%甘油，新鲜蛋白酶抑制剂)。重组 GST-UCHL3 和 UCHL3 CA 在 BL21 细胞中表达，按照标准方案纯化。deubiquitination 测定体外 ,ubiquitinated 蛋白质是孵化与重组 UCHL3 eubiquitination 缓冲区(50 毫米 Tris-HCl pH 值 8.0,50 mM 氯化钠,EDTA 1 毫米,10 毫米德勤,5%甘油)4 h 30C。芯片通过转染 I-SceI 表达质粒，在 U2OS D
8、R-GFP 细胞中诱导单个 DSB。转染后 24 小时，细胞在室温下用 1%甲醛固定 10 分钟，将蛋白质与 DNA 交联。加入甘氨酸(0.125 M) 5 分钟，停止交联。细胞被收获,颗粒在细胞裂解缓冲 resuspended(5 毫米管道(KOH) 在pH 值 8.0,85 毫米氯化钾,0.5% NP-40)亮抑酶肽 1g /毫升,1g /毫升抑肽酶,1毫米 PMSF。核在 2000 克的离心作用下，5 分钟内被离心分离，然后在核溶解缓冲中重新悬浮（50 mM Tris 在 pH.1，10 毫米 EDTA，1%SDS，1 g/mL，1 g/mL aprotinin，1 毫米 PMSF），并
9、将染色质切成平均大小为 0.6 kb 的染色质。用三文鱼精子 DNA/蛋白-琼脂糖浆液 预先清除裂解物。每个上清液的 10%作为输入控制，并通过交联反转步骤进行处理。其余的上层清液与 5g孵化表示抗体在一夜之间在 4C。珠被洗了四次:一次在高盐缓冲(50 毫米 Tris-HCl pH 值 8.0,500 毫米氯化钠,0.1% SDS、脱氧胆酸盐 0.5%,1% NP-40,1 毫米 EDTA),在氯化锂缓冲区(50 毫米 Tris-HCl pH值 8.0,250 毫米 氯化锂,NP-40 1%,0.5%脱氧胆酸盐,1 毫米 EDTA),和两次 TE 缓冲(10 毫米 Tris-HCl pH 值
10、 8.0,1 毫米 EDTA,pH 值 8.0)。然后在洗脱缓冲液(1% SDS, 0.1 M NaHCO3)中重新悬浮，在室温下旋转 20 分钟。洗脱样品孵育 0.2 M氯化钠一夜之间在 65C 到反向交 联。样本孵化与核糖核酸酶为 30 分钟 37C 其次是蛋白酶 K 1 h 在 37C。然后使用 PCR 清理试剂盒对 DNA 进行纯化，并用于定量 PCR 分析。芯片的 PCR 引物,220 个碱基对远离 I-SceI 削减网站如下:向前,5-GAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3;和反向 5-CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC-3。HR 分析我们使用来自 Maria Jasi
11、n 博士( 纪念斯隆凯特琳癌症中心)的 U2OS DR-GFP 细胞，通过 CRISPR 系统产生控制或 UCHL3 敲除 U2OS DR-GFP 细胞系。将 ISceI 表达载体(pCBA-I-SceI)转染到细胞中。在 I-SceI 转染后 2 d 采集 细胞，并使用流式细胞术检测I-SceI 消化诱导的重组。采用 pEGFP-C1 平行转染法对转染效率进行归一化处理。统计数据对于细胞存活试验和 HR 试验，数据提出了均值SEM 的三个独立的实验。对于焦点形成分析，提出了数据作为三个独立的均值SEM。每项实验计数超过 200 个细胞。统计分析采用 t 检验、方差分析或 log-rank 检验。图中有 1 个星号表示 P 0.05, 2个星号表示 P 0.01。
