1、蛋白质胶内酶切步骤一、 溶液准备考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1 ，vol/vol） ；银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/ 硫代硫酸钠覆盖液：25mM 碳酸氢铵溶液；酶液：2ug 分装后的 promega 质谱级胰酶，用 160ul 覆盖液充分混和溶解；萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2 ，vol/vol） ；二、操作步骤1. 水洗胶块 2 次，吸走液体；2. 胶块脱色。1） 考然胶块：加考然脱色液 100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色 1h左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块 2 次，将脱色后
2、的染料洗去，吸走液体；2） 银染胶块：加银染脱色液 50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块 3次，至胶块变得完全无色透明；3. 胶块脱水。加 50%ACN 溶液，让胶块脱水；再加 100%CAN，让胶块变白完全脱水；分别吸走液体；4. 还原烷基化（SDS 一维电泳条带，请做此步；2D 电泳点不需要此步）1) 加入 50ul 10mMDTT 溶液（溶于 25mM NH4HCO3） ， 56水浴 50min；离心，吸走液体；2) 加入 50ul 55mM IAA 溶液（溶于 25mM NH4HCO3） ，避光反应 15min；吸走液体；3) 加入 100ul 水洗胶块，将反应剩余液体吸走；4) 胶块脱水，重复步骤 4；6加入胰酶 5-20ul（具体视胶块大小而定） ，让胶块充分吸胀，变透明 20min，再剩余 1-3ul 的酶液；7. 37 水浴过夜 16h；8. 若做 MALDI-MS 分析，则直接取酶解液上清点样做质谱即可；若做 ESI-LCMS 分析则需要萃取胶内的多肽，分别加 100ul 萃取液，超声 10min 萃取两次，冷冻干燥待做 LCMS；
