1、 国家自然科学基金申请书 2008 版第 1 页 版本1.006.348申请代码： C1401受理部门： 收件日期：受理编号：解 除 保 护国家自然科学基金申 请 书(2008 版 ) 资助类别：地区科学基金项目 亚类说明： 附注说明： 项目名称：急性低血压影响前庭功能的谷氨酸受体机制研究申 请 者： 电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：133000 单位电话：电子邮件：申报日期： 2008 年 3 月 10 日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书 2008 版第 2 页 版本1.006.348基本信息 zYleU7IM姓名 性别 男 出生年月 1958 年 2 月 民族 朝鲜族学位
2、博士 职称 教授 主要研究领域 神经生理学 电话 电子邮件传真 个人网页 工作单位 延边大学 /基础医学院申 请 者 信 息在研项目批准号 名称 代 码 13300201 联系人 电子邮件依托单位信息电话 网站地址单 位 名 称 代 码00000000 合作单位信息在 此 录 入 修 改 项目名称 急 性 低 血 压 影 响 前 庭 功 能 的 谷 氨 酸 受 体 机 制 研 究资助类别 地区科学基金项目 亚类说明 附注说明 申请代码 C1401:人体生理学 基地类别 预计研究年限 2009 年 1 月 2011 年 12 月 研究属性 基础研究 项 目 基 本 信 息申请经费 25.0000
3、 万元摘 要(限 400 字)：很多研究表明前庭影响血压，而申请人又发现血压反过来也能影响前庭功能。急性低血压通过前庭器官改变前庭神经核（vestibular neuclar, VN）功能，且可能与谷氨酸的释放有关，但其受体机制尚不清。本课题提出低血压通过前庭神经释放谷氨酸并与 VN 内相应受体参与继发性血压调节的假说，拟在清醒大鼠损伤一侧前庭器官不同时期，用微量透析、高效液相分析等方法，观察 VN 内谷氨酸含量的变化；结合药理学和免疫组化法，分析受体激动剂和阻断剂对 VN 细胞 pERK1/2 和 c-Fos 表达变化，探讨低血压影响 VN 功能活动的谷氨酸受体类型和细胞内信号变化关系，揭示
4、前庭可能参与继发性血压调节和血压变化所致眩晕的谷氨酸递质及其受体机制。目前国内外尚未见类似报道，将首次揭示正常和一侧前庭损伤不同时期 VN 内谷氨酸及其受体与急性低血压的相关性，为前庭参与血压调节的中枢机制研究提供理论依据，并为治疗相关疾病提供新的思路。关 键 词(用分号分开，最多 5 个) 血压，前庭损伤，前庭神经核，谷氨酸，受体 国家自然科学基金申请书 2008 版第 3 页 版本 1.006.348经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一.研究经费 18.5000 1.科研业务费 3.5000 （1）测试/计算/分析费 0.0000 （2）能源/动力费 0.
5、0000 （3）会议费/差旅费 2.0000 国际国内学术会各 1 次，（4）出版物/文献/信息传播费 1.0000 文献复印、文献检索、论文刊登费等（5）其它 0.5000 2.实验材料费 15.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 12.0000 动物 1.5；免疫 2.0；各种试剂 3.5；流动相1.5；分离柱 3.0；电极 0.5（2）其它 3.0000 透析膜和各种导管 1.5；其他消耗品 1.53.仪器设备费 0.0000 （1）购置 0.0000 （2）试制 0.0000 4.实验室改装费 0.0000 5.协作费 0.0000 二.国际合作与交流费 2.0000 1.项目组
6、成员出国合作交流 1.0000 选派 1-2 名项目组成员出国短期培训和交流2.境外专家来华合作交流 1.0000 聘请 1 名国外专家来华进行学术交流三.劳务费 3.3000 研究生劳务费15%四.管理费 1.2000 5%合 计 25.0000 国家其他计划资助经费 0.0000其他经费资助（含部门匹配） 0.0000与本项目相关的 其他经费来源其他经费来源合计 0.0000国家自然科学基金申请书 2008 版第 4 页 版本 1.006.348报告正文查 看 报 告 正 文 撰 写 提 纲一、立项依据与研究内容研究意义： 位于内耳的前庭器官中的半规管通过感知角加速运动，椭圆囊和球囊则通过
7、感知线加速运动和重力刺激，导致反射性姿势调节。即末梢前庭感受器感知头部的运动，把传入信号经前庭神经传达到前庭神经核（vestibular neucler, VN）后，诱发前庭- 眼球反射；前庭- 脊髓反射；前庭-自主神经反射。关于前庭-自主神经反射中，目前很多研究主要集中在对前庭器官的过度刺激或单侧前庭器官损伤所致恶心、呕吐、眩晕、心率加快、出汗等自主神经症状上。有文献报道，参与血压调节的前庭-自主神经反射是末梢前庭感受器的传入信号到达 VN 后，通过多种中枢神经通路从延髓吻侧腹外侧区神经元传达到交感神经，构成作用于心脏和血管的神经传导径路。众所周知，前庭器官通过感知头部运动后参与血压的调节。
8、但是，血压的变化对前庭器官功能的影响方面研究甚少。原发性低血压、心衰、心梗、心率不齐患者常伴有眩晕症状，但其发生机制并不确切。目前认为可能也与末梢前庭感受器的血流变化有关。血压的降低常常引起眩晕，提示末梢前庭感受器可能对血压的变化起反应，并可能参与继发性血压调节。本实验室利用电生理学和免疫组织化学方法，在麻醉动物发现急性低血压不仅改变前庭神经和 VN 细胞的自发放电活动，而且也能增加 VN 神经细胞内细胞 8 兴奋标志物 pERK1/2 蛋白和 c-Fos 基因的表达、增加谷氨酸的含量，这些变化可被破坏前庭器官所反转。考虑急性低血压时前庭器官的功能改变与前庭神经释放谷氨酸有关，设想若能在清醒动
9、物观察诱发急性低血压时结合药理学方法，观察 VN 区的谷氨酸、pERK1/2 和 c-Fos 的变化，将有助于阐明前庭器官参与血压变化引起的继发性血压调节和血压变化所致眩晕的谷氨酸及其受体机制。谷氨酸的受体有促离子型受体和促代谢型受体，他们被激活后通过细胞内各级酶的级链磷酸化反应或通过调控基因表达改变细胞的功能活动。但是尚无在血压变化时谷氨酸通过什么受体影响 VN 细胞功能的相关研究报道。本研究为了阐明血压的变化通过前庭系统继发性地参与血压调节和急性低血压、心衰、心梗、直立性低血压患者常伴有的眩晕症的谷氨酸受体机制，在清醒自由活动大鼠，利用核团微量透析、高效液项分析、药理学、免疫组化和行为学等
10、方法，观察国家自然科学基金申请书 2008 版第 5 页 版本 1.006.348正常和破坏一侧外周前庭器官不同时期，诱发急性低血压时 VN 内谷氨酸含量、pERK1/2 和 c-Fos 基因的变化和动物行为的改变。国内外研究现状：1974 年 Doba 等首次报道前庭器官参与直立性低血压的调节后，开始了对前庭-自主反射的研究。发现刺激前庭器官可使呼吸变得急促、心律加快、血流重新分布 1-2，并参与动脉血压的调节 3。那么，血压是否也会影响前庭系统的功能活动？有学者指出 4，基底动脉短暂缺血性眩晕患者脑干听力诱发电位也受到抑制，而且老年性眩晕症的 90以上是由于脑血管缺血所致 5。但是尚无内脏
11、功能尤其是血压变化也影响前庭功能的直接报道。根据用硝酸甘油（sodium nitroprusside, SNP）引起低血压和脑血流量改变的相关研究发现，SNP 使血压降低 50以上时脑血流量明显减少，而血压降低不足 50时脑血流量不出现明显变化，但是耳蜗的血流量随着血压的降低成比例减少。认为血压降低 1030时脑血流量并不降低，只改变了前庭器官的血流量。推测这是血压降低可能通过激活 VN 使体循环血压反射性升高的一种代偿性反应 6，提示前庭器官可能继发性地参与血压的调节。我们的研究 7-11也发现，SNP 诱发急性低血压改变前庭传入神经和 VN 神经元的自发放电活动，并增加 VN 内 c-Fo
12、s 基因表达，这种作用被破坏外周前庭器官所反转。由图 1 可见急性低血压增强 VN 内型神经元的活动，却使型神经元的活动则有降低倾向，而在破坏单侧前庭感受器后这种现象发生反转。VN 内 c-Fos 表达实验又发现（图 2），正常动物诱发急性低血压引起两侧 VN 内 c-Fos 基因表达明显增加，破坏单侧前庭器官的动物损伤侧 VN 内 c-Fos 表达并不增加。 Kim12等又报道，失血性急性低血压增加 VN 内 pERK1/2 表达，破坏前庭器官时 pERK1/2 表达则明显减少。提示，血压的降低可以通过前庭器官和 VN 引起前庭反应，其中有前庭感受器的参与，而且前庭器官的刺激不仅影响血压，反
13、过来血压的变化也能影响前庭器官的活动。这种活动可能意味着急性低血压通过前庭器官参与继发性的血压调节。VN 区的神经递质种类繁多，其中至少有谷氨酸可能作为前庭传入神经的初级神经递质或调质发挥作用 13。有文献报道，前庭代偿与其末梢释放谷氨酸及其离子型和代谢型受体 14，也与 GABA 递质 15有关，而在前庭 -眼球反射时前庭器官的传入神经国家自然科学基金申请书 2008 版第 6 页 版本 1.006.348到达 VN 后其末梢释放的递质中有氨基酸类递质（谷氨酸、天冬氨酸、GABA ） 16。本室的最近研究发现 17，用药物或放血等方法在麻醉大鼠诱发急性低血压时，正常动物 VN 内谷氨酸的含量
14、明显增加而牛黄酸含量明显减少，但是损伤单侧前庭器官动物慢性期损伤侧 VN 内谷氨酸和牛黄酸含量没有明显变化。表明急性低血压兴奋末梢前庭感受器，使其传入信号传达到 VN 后分泌谷氨酸来改变 VN 神经元的活动。申请人的预实验已经发现 18，在清醒无麻醉正常大鼠诱发急性低血压时，VN 谷氨酸含量明显增加而牛磺酸含量却明显降低。这种现象在一侧迷路损伤慢性期，损伤侧 VN 区谷氨酸含量则无明显变化，但是牛磺酸含量仍然明显下降，而在健康侧 VN内谷氨酸和牛磺酸含量都明显增加（图 3 和 4） 。但是到目前为止，尚未见到关于急性低血压通过兴奋外周前庭器官，其末梢释放谷氨酸等氨基酸类递质以后，通过何种受体改
15、变 VN 的功能活动的研究报道。主要参考文献：1 Wilson TD, Cotter LA, Draper JA, et al. Vestibular inputs elicit patterned changes in limb blood flow in conscious cats. J Physiol. 2006 Sep 1;575(Pt 2):671-84.2 T. D. Wilson, L. A. Cotter, J. A. Draper，et al. Effects of postural changes and removal of vestibular inputs on b
16、lood flow to the head of conscious felines. J Appl Physiol. 2006,100: 1475-1482, 3 Gotoh TM, Fujiki N, Matsuda T, et al. Roles of baroreflex and vestibulosympathetic reflex in controlling arterial blood pressure during gravitational stress in conscious rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 20
17、04.286: R25R30, 4 唐开雄，陈瑞陶，蔡瑞等. 椎基底动脉短暂缺血性眩晕患者脑血流量与脑干听力诱发电关系研究华西医大学报 2000，31(1)：8081 5 殷国华. 老年人眩晕的病因分析. 山东医大基础医学院学报. 2001，l5 （6）；328-330 6 Hamaguchi M, Ishibashi T, Katsumata N, et al. Effect of sodium nitroprusside(MR7S1) and nitroglycerin on the systemic, renal cerebral and coronary circulation of
18、dogs anesthetized with enflurance. Cardiovasc Drugs Ther. 1992;6:611-6227 Byung Rim Park, Min Sun Kim, Ggue hyn Yee, et al. Changes in vestibular nerve activity following acute hypotension in rats. Korean J physiol pharmacol. 2003,7;85-89国家自然科学基金申请书 2008 版第 7 页 版本 1.006.3488 Min Sun Kim, Jae Hyo Kim
19、, Davy kry, et al. Effects of acute hypotension on expression of cFos-like protein in the vestibular nuclei of rats Brain Research. 2003,962:111-121；9 Min Sun Kim, Jae Hyo Kim, Yuan Zhe Jin, Davy kry, Byung Rim Park. Temporal changes of cFos-like protein expression in medial vestibular nuclei follow
20、ing arsanilate-induced unilateral labyrinthectomy in rats. Neuroscience Letters.2002,319: 9-1210 Yuan Zhe Jin. Guang Shi Jin. Min Sun Kim. Byung Rim Park. Role of central vestibular pathway on control of blood pressure during acute hypotension in rats. J Korean Balance Soc. 2005:4(2):189-20011 Park
21、BR, Kim MS, Kim JH, Jin YZ. Effect of acute hypotension on neuronal activity of vestibular nuclei in rats. Neurorport. 2001,12.3821-3824.12 Min Sun Kim, Myoun Ae Choi, Dong Ok Choi, et al.Asymmetric activation of extracellular singal-regulated kinase 1/2 in rat vestibular nuclei by unilateral labyri
22、nthectomy. Brain research. 2004,1011;238-242.13 Sasa M, Takeshita S, Amano T, et al.Primary neurotransmitters and regulatory substances onto vestibular nucleus neurons. Biol Sci Space. 2001，15(4):371-414 Gliddon CM ，Sansom AJ，Smith PF，et al. Effects of intra-vestibular nucleus injection of the group
23、 I metabotropic glutamate receptor antagonist AIDA on vestibular compensation in guinea pigsExp Brain Res，2000，134(1)：74-8015 Giardino L, Zanni M, Fernandez M, et al.Plasticity of GABA(a) system during ageing: focus on vestibular compensation and possible pharmacological intervention. Brain Res. 200
24、2 Mar 1;929(1):76-8616 Andrianov GN, Puyal J, Raymond J, et al. Immunocytochemical and pharmacological characterization of metabotropic glutamate receptors of the vestibular end organs in the frog. Hear Res. 2005,204:200-209.17 于海玲、安英、邴艳华、金清华、崔勋、金元哲 *. 急性低血压对前庭神经内侧核区谷氨酸和牛磺酸含量的影响. 生理学报.2006，58（2）177-
25、182.18 安英，于海玲，邴艳华，金清华，崔勋，金元哲*. 急性低血压对清醒大鼠前庭神经内侧核区谷氨酸和牛磺酸含量的影响。中国临床康复.2006;10(30):82-85国家自然科学基金申请书 2008 版第 8 页 版本 1.006.3482项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题。研究内容：本研究拟用清醒大鼠，药物或外科手术制备外周前庭器官损伤模型后，用核团内微量透析、高效液相色谱、免疫组织化学、药理学、行为学等方法，探讨急性低血压兴奋 VN 时 VN 内谷氨酸等氨基酸类神经递质含量的变化及谷氨酸受体机制。将有助于阐明血压影响前庭功能，并继发性地参与血压调节的谷氨酸及其受体机制，并
26、为临床治疗相关疾病提供新的思路。实验动物选用 250-300g 的清洁级 Wistar 系雄性大鼠，在清醒状态下进行实验。诱发急性低血压用静脉注射 SNP（15g/kg/min,3min ），使动脉血压下降 30%左右。为了研究前庭代偿的不同时期，急性低血压对 VN 区神经递质含量变化的相关性，实验分前庭感受器损伤后急性期(24, 48 小时)和慢性期(两周后)两个部分进行。外周前庭器官的永久破坏用对氨基苯基砷酸盐行化学性损毁法或外科手术损毁法。（1）正常清醒动物 VN 区谷氨酸含量、pERK1/2 和 c-Fos 的表达。利用神经核团微量透析法和免疫组织化学法，观察 VN 内谷氨酸等氨基酸类
27、神经递质含量、pERK1/2 和 c-Fos 的表达。明确正常清醒动物 VN 内氨基酸类递质的含量和细胞兴奋标志物的表达情况。（2）急性低血压对正常清醒动物 VN 区谷氨酸含量、pERK1/2 和 c-Fos 表达的影响。观察正常清醒动物诱发急性低血压时，VN 内神经递质含量变化、pERK1/2 和 c-Fos 的表达。证实本实验条件下，急性低血压是否兴奋 VN，同时证明谷氨酸参与其中。（3）前庭损伤不同时期急性低血压对清醒动物 VN 区神经递质含量、pERK1/2 和c-Fos 表达的影响。一侧前庭损伤急性期（损伤 24、48 小时）和慢性期（损伤 2 周），观察诱发急性低血压前后双侧 VN
28、 区神经递质、pERK1/2 和 c-Fos 的表达差异。阐明前庭损伤不同时期（A）VN 内上述指标的变化；（ B）急性低血压与上述指标的关系。（4）受体兴奋剂和阻断剂对前庭损伤不同时期清醒动物 VN 区 pERK1/2 和 c-Fos表达的影响。国家自然科学基金申请书 2008 版第 9 页 版本 1.006.348一侧前庭器官损伤后的不同时期用药理学和免疫组织化学法，脑室注入受体兴奋剂和阻断剂（如谷氨酸和谷氨酸的拮抗剂 Dizocilpine, MK-801 等）后比较观察正常和损伤前庭动物双侧 VN 内 pERK1/2 和 c-Fos 表达变化。进一步阐明前庭损伤不同时期受体兴奋剂和阻断
29、剂对 VN 不对称兴奋的影响。同时通过动物行为变化，观察兴奋剂和阻断剂对前庭失代偿行为的影响。（5）受体兴奋剂和阻断剂对前庭损伤不同时期清醒动物诱发急性低血压后 VN 区pERK1/2 和 c-Fos 表达的影响。一侧前庭器官损伤后的不同时期，诱发急性低血压前后观察损伤侧和健侧 VN 内pERK1/2 和 c-Fos 的表达，比较分析两侧的差异。确定前庭损伤不同时期，急性低血压影响 VN 功能受体功能变化。最终验证急性低血压兴奋外周前庭器官，通过前庭神经至少释放谷氨酸并通过相应受体改变 VN 功能的假说，同时阐明前庭损伤不同时期这些递质和受体功能变化的相关性。研究目标：1阐明一侧前庭损伤不同时
30、期，两侧 VN 区谷氨酸含量变化的相关性。2在正常清醒动物，通过诱发急性低血压，观察 VN 内神经递质含量变化，证明急性低血压与 VN 内谷氨酸含量变化的相关性。通过 pERK1/2 和 c-Fos 表达变化证明急性低血压兴奋 VN。3一侧前庭器官损伤的清醒动物，通过诱发急性低血压，观察前庭器官损伤不同时期动物双侧 VN 内神经递质含量的变化，证明前庭损伤不同时期急性低血压与 VN内谷氨酸含量变化的相关性。同样通过 pERK1/2 和 c-Fos 表达变化，阐明前庭损伤不同时期急性低血压前后 VN 功能活动变化。4使用受体兴奋剂或阻断剂后，观察一侧前庭器官损伤的清醒动物 VN 内pERK1/2
31、 和 c-Fos 表达的影响，阐明一侧前庭损伤后，前庭代偿不同时期 VN 的兴奋与相应受体的关系。通过动物行为变化，观察兴奋剂和阻断剂对前庭失代偿行为的影响。5使用受体兴奋剂或阻断剂后，观察急性低血压对一侧前庭器官破坏动物 VN 内pERK1/2 和 c-Fos 表达的影响，确定前庭损伤不同阶段参与急性低血压兴奋 VN 的谷氨国家自然科学基金申请书 2008 版第 10 页 版本 1.006.348酸受体功能变化。拟解决的关键科学问题： 1明确清醒动物 VN 区谷氨酸等氨基酸类递质的含量；2阐明清醒动物急性低血压兴奋 VN 的谷氨酸的受体机制；3阐明清醒动物前庭损伤不同时期，急性低血压与 VN
32、 的谷氨酸含量及其受体功能的关系；4揭示清醒动物一侧外周前庭器官损伤不同时期，前庭代偿与谷氨酸含量及其受体的相互关系；3拟采取的研究方案及可行性分析。拟采取的研究方法和实验手段：（1）动物：本实验选用 250-300g 的清洁级 Wistar 系雄性大鼠。为了消除麻醉对动物心理和行为的影响，实验观察全部在清醒状态下进行。（2）破坏前庭器官：外周前庭器官的永久破坏行化学和手术损毁法。化学损毁法：水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉。从外耳穿透鼓膜向中耳注入对氨基苯胂酸盐（sigma 公司产品，用 0.3M 碳酸钠溶液配成 100mg/ml）后放入脱脂棉，并置动物仰卧位，使药物持续缓慢吸收。可
33、使动物在 6 个小时后开始出现前庭损伤症状。手术损毁法：水合氯醛麻醉，在耳廓后去毛，常规消毒，暴露颞骨下缘、钻开骨缘，露出水平半规管，抽吸外淋巴液，并用聚乙烯管向前庭壶腹处灌注无水酒精后留管，缝合皮肤，肌肉注射抗生素。（3）血压记录和诱发急性低血压：水合氯醛麻醉下，行股动、静脉插管，动静脉导管从后背皮下穿到头部。动脉导管连接 BL420E +型生物机能实验系统，监测血压。静脉注射 SNP（15g/kg/min, 3min）诱发低血压，使血压约下降 30%。（4）植入微量透析探针外套管：水合氯醛麻醉。参照大鼠脑图谱，在 VN 内侧核投射区将透析膜的外套管插入到 VN 区（后囟向后 2.42.9m
34、m，正中线旁开0.91.2mm，深度 6.57.0mm）后牙托粉固定。最后用直径 1cm 的套管套住动静脉管和透析膜的外套管，周围用牙托粉固定。动物手术均在常规消毒下进行，待 24 小时后进行透析液的收集。国家自然科学基金申请书 2008 版第 11 页 版本 1.006.348（5）脑部微量透析法：动物乙醚麻醉，透析膜外套管内插入透析探针。作用透析膜为醋酸纤维膜，有效长度 1.5mm，外径 200m，接触部位用腊封口。微量透析探针（图 5）通过透析用外套管插入到 VN 内固定。把改良林格液用微量灌流泵向大鼠 VN区经透析管以 1.5l/min 速度灌流，同时经样本收集器收集样本，每管收集 1
35、0min，收集量为 15l， 80冷冻，以备神经递质含量分析。实验结束后取脑固定、 60m 连续冰冻切片，中性红染色，光镜下进行组织学鉴定。（6）清醒动物慢性记录法：将动物置于特制的电脑控制圆形代谢笼（直径为28cm；高度 28cm）内饲养，在代谢笼内大鼠可自由活动。该方法能够使为了进行各种记录所设置的导管因动物的活动所致的扭转信息经传感器传送给电脑，通过电脑使代谢笼向反方向旋转使导管恢复正常，保证实验过程中记录用各种导管畅通（图 6）。（7）VN 区透析液的神经递质分析：生物活性物质微量分析系统(Microdialysis Total System DTA-300 和 HTEC-500. E
36、icom. Japan) 利用内置的高效液相色谱分析仪，连续、自动地、经过分离柱和电化学电极一次性测量样品中待测的包括谷氨酸的氨基酸类神经递质。（8）受体阻断剂或兴奋剂的使用：为了探讨急性低血压通过前庭神经释放谷氨酸兴奋 VN 的受体机制，脑室或核团微量给与相应受体兴奋剂和阻断剂（如谷氨酸和拮抗剂 Dizocilpine, MK-801）。（9）免疫组织化学法：利用免疫组化法研究 VN 内 pERK1/2 和 c-Fos 的表达。正常和诱发急性低血压后 5-10min 以内，动物深麻醉、利用 4左右的 0.1%PBS 缓冲液灌流心脏、0.1%PBS 缓冲液稀释的 4%多聚甲醛溶液灌流、剥离脑组
37、织，4%多聚甲醛溶液室温固定、30%的蔗糖溶液脱水，40m 冰冻切片，按着相关要求进行免疫学反应（略）、染色，利用图象分析仪分析。国家自然科学基金申请书 2008 版第 12 页 版本 1.006.348技术路线：前庭正常一侧前庭损伤：急性期（24、48h ）、慢性期（ 2W）急性期慢性期双侧VN区递质含量、pERK、c-Fos表达基础状态下VN区谷氨酸、pERK、 c-Fos表达低血压对VN区谷氨酸、pERK、 c-Fos表达影响低血压对双侧VN区递质、pERK、 c-Fos影响受体激动/阻断剂对双侧VN区低血 压效应影响（pERK、c-Fos）双侧VN区递质含量、pERK、c-Fos表达低
38、血压对双侧VN区递质、pERK、 c-Fos影响受体激动/阻断剂对双侧VN区低血 压效应影响（pERK、c-Fos）技术路线方框图1动物的选择：利用升降姿势反射和旋转实验选择前庭功能正常、体重在 250-300g 的清洁级 Wistar 系雄性大鼠；2动物状态：以清醒状态自由活动大鼠为研究对象，在电脑控制代谢笼中饲养并进行各项实验；3破坏前庭器官：（详见研究方法和实验手段），实验观察分前庭器官破坏急性期和慢性期进行；4诱发急性低血压：静脉注射 SNP 使血压约下降 30%。5前庭损伤急性期实验（一侧前庭损伤 4、48 小时后）：（1）单纯低血压对清醒动物 VN 区各种神经递质含量的影响：选择动
39、物国家自然科学基金申请书 2008 版第 13 页 版本 1.006.348 动物腹腔注射水合氯醛麻醉、留置微量透析探针外套管、动静脉插管，待动物苏醒后代谢笼内饲养，并稳定 24h 以上； 乙醚麻醉、微量透析探针外套管内插入透析探针，并与动静脉插管一起连上实验记录系统； 每隔 10min 钟收集前庭正常动物 VN 区灌流液 3 次，测定和分析灌流液中神经递质含量（以这 3 个含量的平均值作为对照值，比较分析诱发急性低血压后 VN 区各种神经递质含量的变化百分比。下同）； 静脉注射 SNP 诱发急性低血压后，每隔 10min 钟收集灌流液 6 次，测量灌流液中神经递质含量，比较分析与诱发低血压前
40、对照值的差异和随时间的变化；（2）单纯低血压对清醒动物 VN 区 pERK1/2 和 c-Fos 表达的影响： 动物腹腔注射水合氯醛麻醉、动静脉插管，待动物苏醒后代谢笼内饲养，并稳定 24h 以上； 乙醚麻醉、动静脉插管连上实验记录系统； 分别于 SNP 诱发急性低血压后，3、5、7、9min 时，进行动脉灌流固定脑组织、冰冻切片、免疫组化反应，比较分析与对照组 VN 区 pERK1/2 和 c-Fos 表达的差异；（3）低血压对损伤一侧外周前庭器官动物 VN 区各种神经递质的影响： 同 5（1）的； 水合氯醛麻醉、手术破坏外周前庭器官； 在诱发急性低血压实验前 24h 时，乙醚麻醉、留置微量
41、透析探针外套管内插入透析探针，并与动静脉插管一起连上实验记录系统，代谢笼饲养； 分别在破坏前庭器官 24h 和 48h 时，每隔 10min 钟收集诱发急性低血压前NV 区灌流液 3 次，测定和分析灌流液中神经递质含量； 静脉注射 SNP 诱发急性低血压后，每隔 10min 钟收集灌流液 6 次，分别测量双侧 VN 区灌流液中神经递质含量，比较分析与急性低血压前后，双侧 VN 内的差异和随时间的变化；（4）低血压对损伤一侧外周前庭器官动物 VN 区 pERK1/2 和 c-Fos 表达的影响： 同 5（2）的； 破坏外周前庭器官，同 5（3）的。连续观察动物行为学指标的变化（3 周）；国家自然
42、科学基金申请书 2008 版第 14 页 版本 1.006.348 同（2）的和； （5）受体兴奋剂和阻断剂的效应： 动物腹腔注射水合氯醛麻醉、动静脉插管、侧脑室留置注射用外套管，待动物苏醒后代谢笼内饲养，并稳定 24h 以上； 乙醚麻醉、注射用外套管内插入注射管，并与动静脉插管一起连上实验记录系统，稳定 1h 后，脑室注射受体兴奋剂或阻断剂； 观察动物行为学指标； 同 5（2）的和；6前庭损伤慢性期实验（一侧前庭损伤 2 周后）：（1）低血压对一侧损伤前庭器官动物 VN 区各种神经递质影响： 水合氯醛麻醉、手术或化学损伤前庭器官 2 周后进行实验； 收集 VN 区灌流液前 1 天，再次水合氯
43、醛麻醉、留置微量透析探针外套管、动静脉插管，待动物苏醒后代谢笼内饲养，并稳定 24h 以上； 乙醚麻醉、插入透析探针，并与动静脉插管一起连上实验记录系统； 每隔 10min 钟收集前庭正常动物 NV 区灌流液 3 次，测定和分析灌流液中神经递质的成分和含量； 诱发低血压后，每隔 10min 钟收集灌流液 6 次，测量灌流液中神经递质含量，比较分析与诱发低血压前对照值的差异和随时间的变化；（2）低血压对一侧损伤前庭器官动物 VN 区 pERK1/2 和 c-Fos 表达的影响： 同 6（1）的； 乙醚麻醉、动静脉插管连上实验记录系统； 分别于诱发低血压后，3、5、7、9min 时，进行动脉灌流固
44、定脑组织、冰冻切片、免疫组化反应，比较分析与对照组 NV 区 pERK1/2s 和 c-Fo 表达的差异；（3）受体兴奋剂和阻断剂的效应： 同 6（1）的； 乙醚麻醉、注射用外套管内插入注射管，并与动静脉插管一起连上实验记录系统，稳定 1h 后，脑室注射受体兴奋剂或阻断剂； 观察动物行为学指标； 同 6（2）的；国家自然科学基金申请书 2008 版第 15 页 版本 1.006.348关键技术：1在清醒动物，诱发急性低血压和收集前庭神经核灌流液的过程中保证各记录系统管道的畅通；2精密制备规格一致的透析用探针；3短时间内用免疫组化法测定 pERK1/2 和 c-Fos 表达；4VN 准确定位；可
45、行性分析已有研究证明，血压的变化通过前庭神经传入到 VN 后，通过多种中枢神经通路从延髓吻侧腹外侧区神经元传达到交感神经，构成作用于心脏和血管的神经传导径路，而且前庭器官通过感知头部运动后参与血压的调节。另外原发性低血压、充血性心衰、心梗、心率不齐患者常伴有眩晕症状，但其发生机制并不确切。认为可能与末梢前庭感受器的血流变化有关，并可能参与继发性血压调节。我们在麻醉动物发现，急性低血压可通过改变前庭神经和 VN 细胞的自发放电、增加 VN 内 pERK1/2 和 c-Fos 的表达，这些变化可被破坏前庭器官所反转。见于 VN内有谷氨酸，并受前庭传入冲动的影响，推测急性低血压可能通过谷氨酸和相应受
46、体改变前庭系统的功能活动。我们的预实验已经检测到清醒动物诱发急性低血压时，VN谷氨酸含量明显增加而牛磺酸含量却明显降低。这种现象在一侧迷路破坏后同侧 VN区谷氨酸含量则无明显变化，但是牛磺酸含量仍然明显下降，而在健康侧 VN 内谷氨酸和牛磺酸含量都明显增加（图 3 和 4） 。根据申请人的前期实验发现，急性低血压确实通过外周前庭器官激起传入神经兴奋 VN，且其末梢释放的递制中有谷氨酸递质，结合我室在前庭代偿和诱发动物急性低血压对 VN 区氨基酸类递质含量的研究基础，又已经培养了 1 名博士生和 3 名硕士生，发表了相关的研究论文多篇。现又承担一项教育部科技司博士点专项基金前庭代偿中前庭神经核内
47、中枢化学机制研究（2070184002，2007.12-2009.12）。还具备比较完善的血压记录系统多套、电脑控制代谢笼、冷冻切片机、脑内微量物质分析系统 2套、图象分析仪。用于实验的各种消耗品和试剂来源充足，有关技术完全过关。另外每年从韩国的圆光大学校医科大学的生理学教研室能够得到价值人民币 1-2 万元的相关消耗品。鉴于有上述实验条件和研究基础可以保证本项研究的顺利进行。国家自然科学基金申请书 2008 版第 16 页 版本 1.006.3484本项目的特色与创新之处（1）科学意义：经过检索和查新，除了申请人的研究以外在国内外尚未发现类似的研究。本研究提出，急性低血压兴奋前庭神经，通过其
48、末梢至少释放谷氨酸并通过相应受体改变 VN 的功能活动，进而参与继发性血压的调节假说。（2）方法学：首次在清醒大鼠静脉注射 SNP 诱发急性低血压后，结合微量透析、高效液相色普、免疫组织化学等方法，观察急性低血压时 VN 区谷氨酸含量、pERK1/2和 c-Fos 等细胞兴奋标志物质表达变化，同时结合药理学方法研究其受体机制。5年度研究计划、预计研究结果年度研究计划：2009 年 1 月-2009 年 12 月：（1）测量前庭功能正常动物 VN 区神经递质、pERK1/2 和 c-Fos 含量；（2）诱发急性低血压后，观察 VN 区神经递质、pERK1/2 和 c-Fos 含量变化；（3）损伤一侧前庭器官急性期（损伤 24 和 48h，下略），观察健侧和损伤侧 VN区神经递质、pERK1/2 和 c-Fos 含量的变化。同时观察动物行为学指标的变化；（4）损伤一侧前庭器官急性期诱发急性低血压后，观察健侧和损伤侧 VN
